实时荧光PCR检测HMGN5基因mRNA在肺癌组织中水平及临床价值

蒋志强　郝长城

[摘 要] 目的：研究HMGN5基因mRNA在肺癌组织中表达。方法：选取80例肺癌患者与80例非肺癌患者（对照组）的肺组织标本，测定其HMGN5基因转录的mRNA水平进行比较，并分析不同病理类型和临床分期之间的HMGN5mRNA含量差异。结果：肺癌组标本中HMGN5基因转录的mRNA水平显著高于对照组（P<0.05）；各病理分型肺癌组织中HMGN5的mRNA含量间没有显著性差（P>0.05）；TNM分期Ⅰ期II期的肺癌组织中HMGN5基因转录的mRNA含量明显低于Ⅲ期和Ⅳ期（P<0.05）。结论：HMGN5在肺癌组织中的表达显著增高，且临床分期提高，基因表达水平提高，提示HMGN5与肺癌的发生和发展可能存在关联。

[关键词] HMGN5；肺癌；mRNA水平；相关性研究

中图分类号：R734.2 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2015）02-058-03

DOI：10.11876/mimt201502022

肺癌是危害人类健康恶性肿瘤之一，其死亡率仅次于肝癌，非小细胞肺癌约占所有肺癌80%，其5年总生存率仅为15%左右 [1]。随着分子生物学水平研究开展，分子诊断技术作为组织病理学和影像学检查补充策略，不仅可辅助肺癌早期诊断，还能协助判断其发展趋势、判断预后，为分子靶向治疗提供依据[2]。高迁移率族（high mobility group，HMG）蛋白是在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有较高迁移速率蛋白家族，包括：HMGA、HMGB和和HMGN。HMGN是一类与核小体结合核蛋白，其作用是调整染色质结构从而增强其转录和复制[3]。HMGN5又称核小体结合蛋白1（NSBP1），仅在特定组织细胞内表达，其在胞质内定位和含量高低与细胞增殖周期有关，而肺癌中恶性增殖细胞周期调控机制异常。本研究通过实时荧光定量PCR方法测定肺癌组织中HMGN5基因mRNA水平，探讨其对肺癌发生和发展影响，为肺癌诊断和治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年10月至2013年10月我院确诊80例肺癌患者（肺癌组）以及同期疑为肺组织恶变但病理检查阴性80例非肺癌患者（对照组）为研究对象。肺癌组：男54例，女26例；年龄42～81岁，平均（56.8±7.6）岁；组织病理分型：腺癌24例，鳞癌54例，大细胞癌2例；TNM分期：Ⅰ期9例， Ⅱ期15例， Ⅲa期16例， Ⅲb期19例， Ⅳ期21例；无转移者34例，有局部淋巴结转移者31例，有远处转移者15例。对照组：男42例，女38例；年龄33～76岁，平均（53.5±9.6）岁；疾病类型：肺部感染27例，慢性支气管炎24例，肺气肿16例，肺结核10例，肺纤维瘤2例，纵膈肿瘤1例。对照组患者经临床或组织病理检查证实肺组织无恶变且排除有肺癌家族史者。

1.2 方法

提取RNA： 取直径约4mm组织研磨，离心后去上清，加入1mL Trizol，静置10min后加300μL氯仿抽提；离心后取上清用异丙醇沉淀10min，离心后取沉淀；使用75%乙醇洗涤沉淀，离心取沉淀，室温干燥；加入RNA-free去离子水溶解沉淀，测定OD260：OD280，计算RNA含量。逆转录PCR：取RNA2μg ，依次加入1μL Oligo （dT）、DEPC水，混匀后离心，70℃变性10min后立即放入0℃冰水中冰浴5min，计算出M-MLV以及底物量，将底物、引物和酶与逆转录液混匀，设置好PCR参数，逆转录出cDNA用于Real-time PCR反应：95℃预变性2min，然后95℃15s～60℃1min循环45次，最后95℃变性1min后冷却至55℃，读取Ct值，计算出RNA相对表达量。

1.3 评价指标

每个标本读取两次循环阈值（Ct值）后取平均值，ΔCt值以标本中HMGN5基因Ct值减去对照组基因Ct值，ΔΔCt为肺癌组织HMGN5基因ΔCt值减正常组织HMGN5基因ΔCt值。以2-ΔΔCt表示肺癌组织中HMGN5基因相对含量，当2-ΔΔCt>2认为该基因表达水平高。比较肺癌组和对照组病理组织中HMGN5基因转录mRNA水平（以2-ΔΔCt表示）。比较不同病理类型、不同临床分期肺癌组织中HMGN5转录水平。

1.4 统计学方法

使用SPSS18.0统计软件对实验采集数据进行分析，数值变量资料用x±s表示，组间采用配对样本资料t检验；无序分类变量资料用n%表示，采用独立样本R×C列联表资料χ2检验。均以α=0.05为检验水准，P<0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺癌组和对照组mRNA水平

肺癌组患者标本中HMGN5基因转录mRNA水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），数据见表1。

2.2 病理类型及分期与mRNA水平

对各病理类型肺癌组织中HMGN5基因转录mRNA含量进行两两比较，经检验，差异无统计学意义（P>0.05）数据见表2。

TNM分期Ⅰ期肺癌组织中HMGN5基因转录mRNA含量明显低于Ⅲ期和Ⅳ期，差异有显著性（P<0.05）。Ⅱ期肺癌组织中虽然ΔCt 明显高于Ⅲ期和Ⅳ期，但2-ΔΔCt 经t检验分析差异统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

肺癌发生发展生物学过程十分复杂，目前其分子机制研究发现肺癌发生主要与原癌基因激活和抑癌基因抑制相关，随着研究进一步深入，其他与肺癌相关基因作用和机制也得到一定阐述[4]。HMG蛋白是动物细胞核内除组蛋白外含量最丰富蛋白质之一，HMGN通过与核小体动态结合从部分或总体上对细胞内染色质结构进行适当调整，已有不少报道称这一作用可能对肿瘤发生及发展有相关影响[5]。

HMGN5即NSBP1，其基因全长为8600bp ，由6个外显子、5个内显子及非编码区构成，其cDNA序列全长1865 bp [6]。HMGN5结构特点对其生物学作用有着重要意义，其正确空间结构是与连接体组蛋白H1竞争结合核小体基础，可减弱后者对核小体稳定作用从而使染色体结构快速解聚。HMGN家族因分子质量小具有高度流动性，在沿着细胞核持续流动过程中随机地与核小体结合，与之结合成复合体后，高度有序染色体结构复杂性被降低，从而影响DNA转录和修复[7]。

HMGN5 蛋白分布具有一定组织器官特异性并且随个体生长发育发生改变，在幼儿脑和肺组织中并未检测出其表达，但在成人肝、肾、胰腺及骨髓中均有一定水平表达。虽然HMGN5作用具体分子机制尚未完全得到证实，但已有学者报道HMGN5蛋白在前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等组织中表达水平增高，HMG基因重排、断裂与神经胶质瘤、胃肠道肿瘤、女性生殖系统肿瘤以及脂肪瘤等肿瘤发生有关[8]。研究报道[9]称抑制HMGN5表达后，前列腺癌细胞活性降低，且G2/M+S期细胞数目明显下降，这一过程可能与HMGN5参与cyclinB1等细胞周期蛋白调控有关，但目前关于HMGN5基因在肺癌中作用相关报道还比较少。

本次研究结果表明肺癌细胞中HMGN5基因mRNA转录水平显著增高（P<0.05）；肺癌临床分期Ⅲ期和Ⅳ期者组织中HMGN5基因表达水平较早期显著升高（P<0.05），但不同病理分型肺癌组织中HMGN5mRNA含量间没有显著性差（P>0.05）。陈鹏等 [10]使用反义RNA干扰mRNA表达，通过构建小干扰RNA（siRNA）慢病毒表达载体沉默HMGN5基因，结果显示被慢病毒感染后细胞HMGN5mRNA转录水平显著降低，被感染细胞细胞周期中在G0进入G1期时发生阻滞，提示HMGN5沉默可显著抑制肺癌细胞分裂增殖，因而认为HMGN5表达参与了恶性肿瘤发生和进展。阎红娥等[11]研究结果发现非小细胞肺癌中HMGN5阳性率较癌旁组织明显升高，而且其在细胞中定位与细胞进行新陈代谢和增殖关键部位相关，该实验还发现随着肺癌进展，HMGN5表达逐渐呈增高趋势，与本次研究结果相似。作者认为HMGN5主要通过缩短细胞周期，加速癌细胞分裂增殖从而促进肺癌发展。

综上所述，HMGN5基因在肺癌组织中有较高转录水平，且随着疾病进展，其表达水平逐渐升高，为肺癌分子靶向治疗提供了新思路，可能成为抗肺癌分子治疗策略作用新靶点。

参 考 文 献

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