小菜蛾对溴虫腈抗性筛选、风险评估及交互抗性研究

贾变桃，洪珊珊，王 龙

(山西农业大学农学院，山西太谷 030801)

小菜蛾Plutella xylostella(L.)是一种重要的十字花科蔬菜害虫。其繁殖力强，世代重叠严重，具有很强的适应性，属于典型的r-对策害虫;同时小菜蛾具有远距离迁飞能力，在不同地区之间可以相互扩散，给蔬菜生产造成严重危害(Talekar and Shelton，1993)。一直以来，化学农药是防治小菜蛾的主要手段。长期的药剂防治使小菜蛾对各类杀虫剂产生了不同程度的抗药性，这些药剂包括有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、昆虫生长调节剂、苏云金杆菌以及抗生素类杀虫剂阿维菌素和多杀菌素等(Tabashnik et al.，1990;闫艳春等，1997;冯夏等，2001;陆剑飞等;2004;赵峰等，2006)，甚至对新型杀虫剂氯虫苯甲酰胺也监测到了极高水平抗性(胡珍娣等，2012)。

溴虫腈是美国氰胺公司1988年由天然抗生素经结构改造后开发的具有独特作用机理的杀虫杀螨剂，作为一种杀虫剂前体，其本身并无杀虫作用，在昆虫体内经多功能氧化酶作用，脱去N-乙氧基乙基转变为一种氧化磷酸化解偶联剂，作用于虫体细胞内线粒体，干扰质子浓度，使其透过线粒体膜受阻，从而影响ATP 的生成，破坏细胞，最终导致害虫死亡(徐尚成和蒋木庚，2003;欧晓明等，2003)。溴虫腈高效广谱，已进入我国市场，登记用于蔬菜害虫的防治，也是农业部推荐的高毒农药的重要替代品种之一。据黄超燕等(2005)报道，10%溴虫腈悬浮剂1000 倍液可有效控制小菜蛾的为害。随着溴虫腈的大面积推广应用，小菜蛾势必对其产生抗药性。我国浙江(柴伟刚等，2010)、湖南(符伟等，2012)和广东(周丽娟等，2011)等地区，已监测到小菜蛾对溴虫腈产生低到中等水平抗性。目前还未见国内外小菜蛾对溴虫腈室内抗性选育的报道。本研究在室内进行小菜蛾对溴虫腈的抗药性筛选，评估其抗药性风险，进一步测定了小菜蛾对溴虫腈产生抗性后对其他杀虫剂的交互抗性，为合理使用该杀虫剂以及小菜蛾的抗性综合治理提供重要理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

小菜蛾幼虫于2010年秋采自太谷县郊区甘蓝田，带回室内进行饲养，一部分在室内不接触任何药剂的条件下，饲养3年以上作为对照种群;另一部分用溴虫腈进行抗性筛选。饲养环境:温度(25±1)℃，相对湿度70%左右，光周期为14L∶10D。

1.2 供试药剂

100 g/L 除尽悬浮剂(有效成分:溴虫腈，德国巴斯夫公司);150 g/L 安打悬浮剂(有效成分:茚虫威，美国杜邦公司);5%美除乳油(有效成分:虱螨脲，瑞士先正达公司);1.8%爱诺虫清乳油(有效成分:阿维菌素，华北制药集团爱诺有限公司);50%丁醚脲悬浮剂(标正作物科学有限公司);25 g/L 菜喜悬浮剂(有效成分:多杀菌素，美国陶氏益农公司);200 g/L 康宽悬浮剂(有效成分:氯虫苯甲酰胺，美国杜邦公司)。

1.3 生物测定方法

采用浸叶法。取未接触农药的新鲜甘蓝叶片，剪成大小一致，浸入系列浓度药液中20 s，以清水(含0.02%的Triton X-100)作为对照。处理叶片在室温下晾干后放入直径为6.5 cm 的培养皿中，培养皿底部用湿滤纸保湿。每培养皿放1 张处理叶片，接大小一致的3 龄幼虫10 头。每处理重复3 到4 次。试验条件:温度(25±1)℃，湿度70%左右，光周期为14L∶10D。溴虫腈和多杀菌素处理48 h，茚虫威、虱螨脲、丁醚脲、阿维菌素和氯虫苯甲酰胺处理72 h 后检查结果。试虫死亡判定标准为:虫体变黑，或用镊子触碰虫体无反应，或虫体已严重变形，行动不正常者。用POLO 软件计算毒力回归方程的斜率(slope)、标准误、LC50及其95%置信限。

1.4 抗性筛选方法

根据每代测定的毒力数据，以LC30剂量进行筛选(F1代筛选剂量为LC15)。筛选方法同1.3。每代筛选试虫数至少600 头。48 h 后更换新鲜叶片并统计死亡率，直至化蛹。

1.5 估算现实遗传力及预测抗性发展速率

根据Tabashnik ＆ McGaughey(1994)改进的分析方法估算现实遗传力h2=R/S。选择反应R=(筛选n 代LC50的对数值-筛选前亲代LC50的对数值)/n;选择差异S=iδp，其中选择强度i=1.583-0.0193336 P+0.0000428 P2+3.65194/P(10＜P＜80)(P=100-平均校正死亡率)，表现型标准差δp 为筛选各代毒力回归线的斜率的平均值的倒数。

根据现实遗传力h2，可以预测筛选后抗性上升x 倍所需代数［Gx=lgx/(h2S)］，以及不同选择压力(50%-99%)下，抗性上升10 倍所需的代数［G=R-1=1/(h2S)］。

1.6 交互抗性的测定

分别测定未筛对照种群和筛选种群对多杀菌素、茚虫威、虱螨脲、丁醚脲、阿维菌素和氯虫苯甲酰胺这6种杀虫剂的毒力(方法同1.3)，以确定小菜蛾对溴虫腈产生抗性后，是否对上述药剂具有交互抗性。

2 结果与分析

2.1 溴虫腈对小菜蛾的室内抗性筛选

用溴虫腈对采自太谷郊区的小菜蛾田间种群进行抗性筛选，饲养20 代期间共筛选18 代，LC50由筛选前的5.201 mg/L 上升到20 代时的250.673 mg/L，抗性增长48.2 倍，达到了高水平抗性。其中，F0-F14期间，共筛选11 代，抗性持续增长，饲养到14 代时，与起始种群相比为41.5倍，达到了高水平抗性。但由于抗性还不稳定，以后几代筛选抗性有所下降，但都保持在中等水平，到20 代时，抗性倍数为48.2，再次达到了高水平抗性(表1)。

表1 溴虫腈对小菜蛾太谷种群的抗性筛选Table 1 Resistance selection of Plutella xylostella to chlorfenapyr(Taigu，Shanxi Province)

2.2 小菜蛾对溴虫腈的抗性风险评估

计算了不同筛选阶段的抗性现实遗传力。饲养20 代，实际筛选18 代，抗性现实遗传力h2=0.465。前9 代筛选的现实遗传力(h2=0.563)远远大于后9 代筛选的现实遗传力(h2=0.078)。这表明由于加性遗传方差导致的抗性表现型方差的比例在筛选过程中下降(表2)。

表2 小菜蛾对溴虫腈的抗性现实遗传力Table 2 Realized heritability of resistance to chlorfenapyr in Plutella xylostella

由于室内的筛选环境比田间相对稳定，环境方差要小于田间，因此估算的h2可能比田间的实际值偏高。假设现实遗传力h2为室内筛选的估算值的一半，可能更接近于田间实际。假设溴虫腈对小菜蛾的致死率为50%、60%、70%、80%、90%和99%，现实遗传力为室内估算值的一半时，对抗性提高10 倍所需的代数进行了预测(假设筛选前后毒力回归线的斜率为2.7，即δp=0.370，该假设斜率接近于室内筛选过程中的平均斜率)。从图1 可以看出，小菜蛾的抗药性发展速率随药剂选择压的升高而加快。在溴虫腈控制的选择压为80%-90%时，预计小菜蛾对溴虫腈抗性增加10 倍，需要6.6-8.3 代。

图1 溴虫腈不同选择压力对抗性发展速率的影响(斜率2.7，δp=0.370)Fig.1 Effect of selection pressure caused by chlorfenapyr on resistance developmental rate(slope 2.7，δp=0.370)

2.3 抗溴虫腈小菜蛾品系的交互抗性研究

当溴虫腈筛选小菜蛾18 代时，测定了该筛选种群对阿维菌素、虱螨脲、氯虫苯甲酰胺、多杀菌素、茚虫威和丁醚脲的敏感性。结果表明:溴虫腈筛选种群对阿维菌素、虱螨脲、氯虫苯甲酰胺、多杀菌素和茚虫威抗性倍数分别为1.6、1.2、1.5、1.1 和0.8，均无交互抗性;对丁醚脲的抗性倍数为3.4，筛选和未筛选种群95%置信限没有交叉，说明有显著差异，但是否具有交互抗性还有待于进一步研究证实(表3)。

3 结论与讨论

研究表明，害虫如果长期处于低剂量药剂的选择压力下，敏感个体不断被淘汰，抗药性个体逐代存活下来，有利于种群抗药性的积累和发展。高宗仁等(1991)用低剂量溴氰菊醋、氧化乐果、杀虫脒和三氯杀螨醇对朱砂叶螨连续选择3 代后，其对这4种药剂敏感性分别降低了6.23、1.16、1.23 和2.24 倍。李瑞娟等(2005)用梅岭霉素和溴虫腈连续处理二斑叶螨10 代，对梅岭霉素抗性增长9.2 倍，对溴虫腈抗性增长10.0 倍。龚佑辉等(2010)用多杀菌素LC25剂量对西花蓟马连续处理47 代后，其敏感性下降了6.72 倍。本研究中，用溴虫腈LC30处理小菜蛾18 代，小菜蛾对溴虫腈敏感性下降了48.2 倍，产生了高水平抗性。说明在长期低剂量的选择压下，小菜蛾具有对溴虫腈产生高抗性的风险。

表3 溴虫腈筛选小菜蛾对其他杀虫剂的交互抗性Table 3 Cross-resistance of chlorfenapyr-selected Plutella xylostella to other insecticides

抗性发展速率除了与选择压有关外，还与种群的抗性等位基因频率有关。已知现实遗传力是加性遗传方差与表现型方差的比率，而加性遗传方差是相应抗性等位基因频率的函数，当抗性基因频率处于中等水平时加性遗传方差和h2最高，当抗性等位基因频率接近于0 或100% 时，h2最低，趋近于0(Falconer，1989)。从表2 可以看出，18 代筛选期间，前半段筛选现实遗传力(h2=0.563)远大于后半段筛选的现实遗传力(h2=0.078)，这与小菜蛾、烟蚜夜蛾和马铃薯甲虫对Bt 的前半段和后半段筛选的抗性现实遗传力情况一致(Tabashnik，1992)，也类似于小菜蛾对丁烯氟虫腈前半段和后半段的抗性现实遗传力(牛洪涛等，2008)。这说明小菜蛾田间种群存在抗性基因，由遗传变异而使抗性表现型在下代可实现的比例h2较大，抗性发展较快，但随着筛选的进行，敏感基因逐步被淘汰，抗性基因在种群中逐渐趋于稳定，遗传变异在抗性表现型中所占比例下降，抗性发展减慢，h2减小。

应用阈性状分析法，估算得小菜蛾对溴虫腈的抗性现实遗传力为0.465，大于小菜蛾对Bt(Tabashnik，1992)、阿维菌素(梁延坡等，2010)和丁烯氟虫腈(牛洪涛等，2008)的抗性现实遗传力，说明小菜蛾对溴虫腈产生抗性的风险要高于这3种药剂。由于在室内选择环境固定，环境方差的变化小于田间，这样导致室内估算的h2可能比田间的实际值偏高，因此，我们在进行抗性发展速率预测时，假定h2为室内实际估算值的一半。此时，当溴虫腈选择压为80%-90%时，预计小菜蛾抗性增加10 倍，仅需要6.6-8.3 代。这表明小菜蛾对溴虫腈抗性风险较高。

交互抗性测定结果表明，小菜蛾对溴虫腈产生48.2 倍高水平抗性后，对阿维菌素、虱螨脲、氯虫苯甲酰胺、多杀菌素和茚虫威不表现交互抗性;但对丁醚脲的抗性倍数为3.4，表现为敏感性下降。这两种药剂都作用于线粒体，影响呼吸作用及能量转换，且都与多功能氧化酶有关，因此，它们之间具有交互抗性是可能的。但二者交互抗性处于何种水平，需要继续筛选，待抗性提高到一定程度后作进一步研究。

虽然室内筛选结果不能直接应用于田间，但仍提供了抗性产生的明确证据，为预防性抗性治理措施的制定提供了重要参考。根据以上研究结果，建议田间防治小菜蛾时应尽可能限制溴虫腈的使用次数，同时注意与其他不具交互抗性的杀虫剂之间的交替轮换使用，降低选择压，以延缓抗药性的产生。

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