噻可拉林对甲状腺髓样癌TT细胞体外增殖的影响

金涛，王晔，戴雪明

(上海交通大学附属第一人民医院，上海200080)

甲状腺髓样癌(MTC)是一种神经内分泌肿瘤，恶性度较高，早期即能转移至肝脏、肺、骨骼以及纵隔［1～4］。50%～80%MTC 患者在就诊时已经发现转移病灶［5］。手术治疗是其主要治疗手段，但多数患者手术后会复发［2］。因此，寻找靶向抑制MTC细胞增殖的方法成为目前治疗MTC的方向。噻可拉林是一种硫代缩酚酸肽双嵌入剂，对乳腺癌、肺癌、结肠癌等肿瘤细胞均有细胞毒性，能诱导肿瘤细胞G1期停滞［6～8］。2013年 6月～2015年 1月，我们观察了噻可拉林对人甲状腺髓样癌TT细胞株(MTC-TT细胞)体外增殖的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 MTC-TT细胞购自中国典型培养物保藏中心。主要试剂:RPMI-1640培养基、FBS，美国Gibco公司;胰蛋白酶、MTT、DMSO，美国 Sigma公司;细胞周期检测试剂盒，美国invitrogen公司。携带红色荧光的pRFP质粒由北京金唯智生物科技有限公司构建，噻可拉林购自马尔药品公司。主要仪器:酶标仪、荧光显微镜、流式细胞仪等。

1.2 MTC-TT细胞培养 MTC-TT细胞培养于含有16%FBS、150 U/mL青霉素、150 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，于5%CO2、37℃培养箱中常规培养，0.25%胰蛋白消化传代。

1.3 MTC-TT细胞增殖检测 采用MTT比色法。取对数生长期MTC-TT细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，接种至96 孔板，每孔100 μL。分别给予0、1、2、4、6、8、10、20、30 nmol/L 噻可拉林，每种浓度设 4个复孔，培养72 h。终止培养前4 h，分别加入40 μL MTT，使MTT终浓度为1 mg/mL。结束培养，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，酶标仪492 nm处测定每孔吸光度(OD)值。细胞增殖抑制率=(对照组OD-实验组OD)/对照组OD×100%。

1.4 MTC-TT细胞周期测定 采用流式细胞仪检测。取对数生长期MTC-TT细胞，消化后1 200 r/min离心10 min收集细胞，PBS洗涤去除血清，以无血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，置培养瓶中培养24 h，终止培养，收集细胞。调整细胞密度为1×106个/mL，将细胞接种于6孔板，每孔2 mL，随机分为观察组、对照组。观察组加入10 nmol/L噻可拉林，对照组加入等量无血清培养基，分别于培养12、24、48、72 h 收集两组细胞，1 000 r/min 离心 10 min，PBS 洗涤，300 μL PBS 重悬，然后加入 700 μL预冷的无水乙醇(终浓度为70%)，4℃冰箱过夜;1 000 r/min 离心 10 min，PBS 洗涤，450 μL PBS 重悬，加入 50 μL RnaseA(2.5 mg/mL)，4 ℃ 孵育 30 min;向每管细胞中加入50 μL PI(1 mg/mL)，4℃避光孵育30 min，流式细胞仪分析细胞周期。

1.5 MTC-TT细胞形态观察 按照 lipofectamine 2000转染试剂盒说明说书进行操作。取对数生长期MTC-TT细胞进行稳定转染，G418(终浓度为500 μg/mL)筛选至第14天，即得到稳定携带红色荧光蛋白基因的MTC-TT细胞。取转染pRFP质粒的MTC-TT对数生长期细胞，接种于6孔板中，每孔2×105个细胞，分别给予0、5、10 nmol/L噻可拉林处理48 h，荧光显微镜下观察细胞形态变化。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 各浓度不同作用时间MTC-TT细胞增殖抑制率比较 见表1。

表1 噻可拉林对MTC-TT细胞体外增殖的影响

2.2 两组不同时间MTC-TT细胞周期分布比较见表2。

表2 两组不同时间MTC-TT细胞周期分布比较(±s)

表2 两组不同时间MTC-TT细胞周期分布比较(±s)

注:与对照组同细胞周期比较，*P＜0.05;与同组其他时间比较，△P ＜0.05。

组别12 h 24 h 48 h 72 h对照组G0/G1 期 60.11 ±3.48 60.52 ±3.02 59.79 ±3.59 69.42 ±2.35 S 期 21.61 ±1.46 21.08 ±1.43 22.14 ±1.51 17.68 ±1.19 G2/M 期 18.28 ±1.21 18.40 ±1.27 18.07 ±1.36 12.90 ±1.04观察组G0/G1 期 69.75±2.83* 71.85±2.94* 81.13±3.27＊△ 72.71±2.81*S 期 12.21 ±1.15* 8.19 ±0.86* 2.07 ±0.21＊△ 10.93 ±0.91 G2/M 期 18.04 ±1.33 19.96 ±1.49 16.80 ±1.28 16.36 ±1.31

2.3 MTC-TT细胞形态变化 与加入0 nmol/L噻可拉林比较，加入5、10 nmol/L噻可拉林的MTC-TT细胞培养48 h，细胞数量明显减少，大量细胞变形、凋亡，以加入10 nmol/L噻可拉林效果最明显。

3 讨论

MTC是由RET原癌基因突变而引起的一种内分泌恶性肿瘤。RET原癌基因定位于人类10号染色体的长臂，编码蛋白为酪氨酸蛋白激酶受体超家族成员。该蛋白与细胞内受体和配体结合后，首先二聚体化，然后启动自身磷酸化和细胞内底物磷酸化，从而诱导细胞增殖。当甲状腺滤泡旁C细胞RET基因突变后，RET构象发生改变，导致其转化能力增强，从而增强RET自身磷酸化和细胞内底物磷酸化程度，导致甲状腺细胞增殖过度而出现癌变［9～12］。因此，寻找抑制MTC-TT细胞增殖的药物，是治疗MTC的有效途径之一。

噻可拉林是一种相对疏水性化合物，在人体内血浆半衰期只有4 h，故其在体内的作用效果不明显。本研究通过体外实验观察噻可拉林对MTC-TT细胞体外增殖的影响，发现不同浓度噻可拉林均能抑制MTC-TT细胞增殖，且浓度为10 nmol/L、作用48 h时，体外抑制效果最佳;荧光显微镜下观察可见，10 nmol/L噻可拉林能明显抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡;进一步研究发现，10 nmol/L噻可拉林能诱导MTC-TT细胞G0/G1期阻滞，从而抑制细胞增殖。因此，噻可拉林有望成为治疗MTC的靶向药物。今后进一步研究解决噻可拉林的疏水性，延长其在体内的半衰期。

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