光果西南杨带芽茎段的组培技术研究

代仕高，程秦明，贺 维，辜云杰，贾 晨，李佳泳，张 炜

(1.四川林业科学研究院，四川成都 610081;2.稻城县林业局，四川 稻城 627750;3.四川农业大学，四川 雅安 625014)

杨树是世界各国普遍种植的木本植物，属杨柳科(Salicacea)杨属(Populus L.)，具有适应性强、生长速度快、丰产等特性，已被广泛作为短期轮作的造林树种，在生态环境治理和解决木材短缺方面占有重要地位［1］，共分为胡杨派、白杨派、黑杨派、青杨派和大叶杨派五大派系。光果西南杨(Populus schneideri var.tibetica)属青杨派(Section tacamchaca spach)，为我国特有树种，主要分布于四川西部、西藏西部至东南部地区，海拔可达3 900 m，胸径年平均生长量1.1 cm以上，树高年平均生长量0.8 m以上，是一种适应性和抗逆性强、生长迅速、材质优良的速生树种［2］。近年来，作为在川西高原宽谷地带推广的主要树种，光果西南杨的大面积营造，不但可以加快高原宽谷区的荒地绿化，提高森林覆盖率;还能满足用材、水土保持、水源涵养、防风固沙等方面的需要，较好地发挥生态、经济和社会效益。植物组织培养作为在短时间内大量繁殖出性状一致的良种的最佳途径，有效合理的运用可以使大面积造林更加快捷、便利。

尽管杨树的组织培养技术日趋成熟，但对不同的杨树品种而言，外植体、培养基、生长调节物质和温度、光照等因子的作用存在较大差别，需要在实验过程中做出必要的调整，通过对各个因子的优化，获得最佳的培养效果。因此，本研究以光果西南杨带芽茎段为外植体，对组培过程中最佳培养方法进行研究，为光果西南杨苗木的大量繁殖以及遗传改良提供技术储备。

1 材料与方法

1.1 材料与培养条件

材料为1 a生光果西南杨(Populus schneideri var.tibetica)，从稻城县采回光果西南杨的枝条，在成都扦插成活后备用。组织培养温度均为(25±2)℃，光照强度1 000 lx～1 500 lx，光照时间16 h·d-1。

1.2 外植体获得

外植体通过以下两种方法进行选择，方法一:杨树扦插茎段萌发后，直接取带芽茎段，去污剂清洗，流水冲洗30 min;方法二:扦插苗移栽后，温室培养1-2个月左右，取带芽茎段，去污剂清洗，流水冲洗30 min。结果显示:方法二获得带芽茎段染菌率低，腋芽启动率高。

外植体消毒处理:先用70%(V/V)的酒精分别消毒 30 s、45 s、60 s;后用升汞(0.1%(W/V))分别消毒6 min、8 min、10 min，对比染菌率及致死情况，如表1。

1.3 不定芽诱导

诱导、增殖、壮苗和生根培养均采用MS基本培养基，外加3%蔗糖和0.6%琼脂，pH为5.8。用无菌滤纸吸干带芽茎段表面的水分，获得无菌外植体。将无菌带芽茎段接种于含不同浓度6-BA(0.05 mg·L-1、0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1)和 NAA(1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、4.0 mg·L-1、6.0 mg·L-1)的不定芽诱导培养基上，诱导不定芽。共6个处理，每个处理接15瓶，每瓶接种两个外植体。培养15 d后统计诱导率。

1.4 再生芽增殖

将上述经过诱导得到的不定芽分株、切割，然后转入NAA(0.1 mg·L-1)和不同浓度6-BA(0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1)的继代培养基上，培养条件同上。共3个处理，每个处理接20瓶，每瓶接种两个不定芽。20 d后观察和统计不同激素浓度对再生芽形成的影响，计算增殖系数。

1.5 再生苗壮苗

经过继代增殖培养的无菌苗矮小，需进一步继代培养，此阶段的试验目的在于使无菌苗健壮和长高。根据预备实验，壮苗培养基为MS+NAA 0.1+6-BA 0.5。

1.6 壮苗后生根

分别以MS和1/2 MS为基本培养基，添加NAA(0 mg·L-1、0.5 mg·L-1)。选取长势好的无菌苗，接种在生根培养基上，共3个处理，每个处理接20瓶，每瓶接种两个无菌苗。15 d后开始观察根的生长情况，统计生根率。

1.7 生根苗移栽

取根系伸长至2 cm～3 cm、植株高为3 cm～4 cm的幼苗进行移栽。揭去培养瓶上的封口膜，在塑料大棚中炼苗3 d，注意保持培养基表面湿润。然后移栽到蛭石∶营养土=1∶1的基质中，移栽时套袋保湿，3 d后，逐步去掉套袋。

1.8 数据统计分析

采用SPSS17.0数据分析系统和Microsoft Excel对试验观察数据资料进行方差分析、LSD多重比较等。在结果统计中所涉及的测定项目计算公式如下:

诱导率(%)=长出腋芽的外植体数 /接种的外植体数×100

增殖系数 =继代后的不定芽数 /接种不定芽数

生根率(%)=生根苗数 /接种苗数×100

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理对外植体灭菌效果的影响

如表1所示，不同消毒处理对外植体灭菌效果的结果表明:70%(V/V)酒精消毒30 s，外植体染菌率高达90%(1号培养基);而酒精消毒60 s后培养发现，外植体出现死亡，茎段变黑现象(7、8、9号培养基)。70%(V/V)酒精消毒45 s后，再用0.1%(W/V)升汞消毒6 min，外植体染菌率高达45%(4号培养基);而消毒10 min后，出现启动迟缓甚至致死的现象(6号培养基)。由此可见，最佳处理方法为酒精消毒45 s，升汞消毒8 min，外植体的污染率仅5%(5号培养基)。

表1 不同消毒处理对外植体灭菌效果的影响Table 1 Effects of different disinfection on explants sterilizing

2.2 不同植物生长调节剂对不定芽诱导的影响

表2显示，在本试验的不定芽分化中，NAA和6-BA的比例对不定芽分化影响较大。当NAA浓度一定时，随着6-BA浓度的增加，外植体芽诱导率呈先升后降的趋势，且外植体茎段在(2)号培养基上诱导效果最佳，10 d后腋芽萌发，芽诱导率达79%，30 d左右可以进行增殖培养。而在6-BA浓度不变的情况下(2、5、6号培养基)，低浓度NAA明显促进芽诱导，而NAA浓度增加芽诱导率减小。故NAA与6-BA比例为1∶40时(2号培养基)，可以促进细胞的分裂和分化，增大外植体的芽诱导率。

表2 不同植物生长调节剂对不定芽诱导的影响Table 2 Effects of plant growth regulators on the induction of adventitious buds

2.3 植物生长调节剂6-BA对再生芽增殖的影响

从表3中可以发现，基本培养基类型均为MS以及NAA浓度均为0.1 mg·L-1的情况下，不同浓度的6-BA对外植体再生芽增殖的影响不同。具体表现为:增殖系数随6-BA浓度的升高逐渐增大，其中，(3)号培养基中增殖效果最好，增殖系数达到5.8。再生芽增殖时，可能由于其自身可以合成内源激素，故NAA与6-BA的比例与不定芽诱导相比稍有下降(比例为1∶20)。

表3 植物生长调节剂6-BA对再生芽增殖的影响Table 3 Effects of plant growth regulators 6-BA on the proliferation of regeneration buds

2.4 植物生长调节剂NAA对生根的影响

在表4中，培养基中不添加NAA，将MS培养基与1/2MS培养基做对比，发现1/2MS培养基对外植体茎段生根的促进作用大于MS培养基，即(2)号培养基生根效果优于(1)号。而在培养基类型一致(均为1/2MS)的条件下，添加0.5 mg·L-1NAA后生根率增加了15%，表明NAA对外植体的增根效果明显，即(3)号培养基增根效果最佳。光果西南场带芽茎段的不定芽诱导和再生情况见图1。

表4 植物生长调节剂NAA对生根的影响Table 4 Effects of plant growth regulators NAA on the percentage of rooting

3 结论

光果西南杨组织培养效率受多个因子的影响。基本培养基能保证培养物的生存与最低生理活动，但只有配合使用适当的外源激素才能诱导细胞分裂启动、愈伤组织生长以及根、芽分化等合乎理想的变化［3］。常用于组织培养的植物激素有两大类:即生长素类和细胞分裂素类。生长素通常被用于诱导细胞的分裂和根的分化，而细胞分裂素主要是促进细胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定芽，对根的发生具有抑制作用［4］。在器官发生和增殖过程中，细胞分裂素和生长素的比例非常重要［5］。

图1 光果西南杨带芽茎段的不定芽诱导和植株再生Fig.1 Adventitious buds induction and plant regeneration of P.schneideri's stems with buds

污染、褐化、玻璃化被认为是组织培养的3大杀手。与褐化、玻璃化相比污染更易发生，给科研和生产带来巨大的危害。因此采取有效的防控措施，降低污染发生的机率，是组织培养成功的重要保障［6］。本实验中，在启动培养阶段，采用温室培养方法，获得污染较少的带芽茎段作为外植体，通过不同灭菌时间处理来控制污染，发现消毒时间过短灭菌不彻底，消毒时间过长茎段变黑，启动迟缓甚至致死。结果显示，酒精消毒45 s，升汞消毒8 min的灭菌效果最好，其污染率降到了5%，可以快速建立杨树的无菌培养体系。

生长素与细胞分裂素在植物组织培养中诱导器官分化的协同调控作用极为重要，需要针对具体外植体类型进行细胞分裂素和生长素最适浓度及比例的筛选［7，8］。在不定芽的诱导和增殖阶段，通过调节MS培养基中NAA和6-BA的配比，建立带芽茎段分化不定芽的再生体系，在短期内可以获得大量的不定芽，提高光果西南杨的繁殖系数。本实验中，适宜浓度的6-BA有利于外植体诱导，而6-BA浓度过低或过高则不利于外植体诱导;而低浓度的NAA对不定芽诱导具有促进作用，高浓度具有抑制作用。这说明:光果西南杨在不定芽诱导时主要依靠内源激素，少量的外源激素可补充内源激素的不足促进其抽芽［9］。在大部分的生根实验中，生根的基本培养基均采用1/2MS培养基［10，11］，因为培养基中的无机盐分减半会促进生根和侧根发育［12］。本实验同样采用1/2MS培养基，并在培养基中添加适量NAA后生根率增加了15%，增根效果明显，这加快了培养速度。

综合已有的研究结果可以看出，较合适的组织培养模式是:MS为基本培养基、适当的NAA和6-BA配比和适宜的培养环境。实际操作过程中，还应针对不同培养阶段的培养目标，选择相应的技术措施。

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