一氧化氮在打破杜梨种子休眠中的作用

宋要强，屠荫华，惠 伟

(1.陕西师范大学生命科学学院，陕西西安 710062;2.陕西化龙山国家级自然保护区管理局，陕西镇坪 725600;3.岐山县食品药品监督管理局，陕西岐山 722400)

杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge)是蔷薇科棠梨属落叶乔木，是梨、苹果等嫁接繁殖的优良砧木;而且杜梨根系发达适应性强是荒山造林的先锋树种。但是杜梨种子成熟后有较长的休眠，采收后必须经过长时间的低温层积处理才能萌发，费时费力，损失严重。因此研究杜梨休眠有很高的理论价值和实用价值。关于打破杜梨种子休眠的研究比较少，只有几篇GA、ABA、6-BA参与杜梨休眠的报道，但是NO在杜梨种子休眠中的作用至今还未见报道。NO是植物体内存在的信号分子，调节着NO参与植物生长发育、种子萌发、气孔运动、细胞凋亡以及植物抗逆反应等生理过程［1～3］。最近研究发现NO在拟南芥［4］、温季牧草［5］、苹果［6］等植物种子的休眠解除中也起着非常重要的作用。

经过多年的研究，大家公认的植物体内NO合成途径有3条:(1)一氧化氮合成酶(NOS)的合成途径［7～9］，(2)硝酸还原酶(NR)的生成途径［10，11］，(3)非酶促反应生成途径［12］。

本研究以杜梨为实验材料，研究了NO在打破杜梨种子休眠中的作用，及杜梨种子萌发时内源一氧化氮的合成途径，为种子休眠的理论研究提供试验依据，同时为生产上打破休眠提供技术参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料和仪器

购买2013年当年的杜梨(Pyrus betulifolia Bunge)种子，购入后于玻璃瓶内密闭，4℃低温保存。实验用硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)、2-苯基-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-1-氧-3-氧化物(PTIO)、NG-氮-L-精氨酸-甲酯(L-NAME)为美国sigma公司生产。氯化汞(HgCl2)和钨酸钠(Na2WO4)来自国内。

光照培养箱是上海悦丰仪器仪表有限公司生产的GC-250型微机光照培养箱。

1.2 种子处理

种子经过0.1%的HgCL2溶液消毒3 min、冲洗后，在20℃下蒸馏水中浸泡24 h，让实验种子吸水膨胀。浸泡后用浓度为1 mM，5 mM，10 mM，20 mM的外源NO供体SNP处理，以蒸馏水处理为对照，处理时间为24 h，温度20℃。为了检验NO的作用和NO的合成途径，进行了NO清除剂PTIO、NO合酶抑制剂L-NAME和硝酸还原酶抑制剂Na2WO4的处理，PTIO处理浓度为200μg·L-1，Na2WO4处理浓度为10 mM，L-NAME处理浓度为200 μM;处理时间24 h，处理在20℃的培养箱内进行。

1.3 种子培养

用培养皿滤纸法培养:培养皿直径90 mm。处理后倒出处理液，蒸馏水冲洗4次～5次，后均匀平铺在培养皿中培养，培养皿中铺一层滤纸，加5mL蒸馏水。每个培养皿30粒种子，每个处理3个重复。培养在光照培养箱内进行，温度20℃，光照周期为12 h光照和12 h黑暗。

1.4 发芽率的测定

开始发芽后每天固定时间对发芽率进行统计，胚根突破种皮为发芽。发芽率(%)=发芽个数÷30×100%。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的SNP对杜梨种子休眠的影响

经24 h浸泡杜梨种子充分吸水膨胀后，用不同浓度的SNP处理种子的萌发情况见图1，从中可以看出SNP处理从1到20 mM都能提高杜梨种子萌发率，随着SNP浓度的增加，杜梨种子萌发率也随之增加，SNP浓度越高，萌发率越高。10 mM和20 mM SNP处理的种子14 d时萌发率分别达到56.7%和58.9%，是对照(20.0%)的2.8倍和2.9倍，差异极显著(P＜0.01)。20 mM和10 mM差异不显著，但是20 mM的SNP处理抑制芽的伸长，甚至引起幼苗的死亡，因此10 mM SNP是打破杜梨种子休眠较合适浓度。

图1 不同浓度SNP对杜梨种子休眠的影响Fig.1 Effect of different concentrations of SNP on the dormancy of Pyrus betulifolia seeds

2.2 PTIO在打破杜梨种子休眠中的作用

为了验证NO在打破杜梨种子休眠中的作用，观察了NO清除剂PTIO处理种子的萌发实验，与SNP处理进行对比，结果如图2。经过SNP处理杜梨种子在培养过程中迅速萌发，萌发率有较大提高，并与对照有极显著差异。在生长上与对照相比，幼根明显伸长，子叶增大变绿。同样培养条件下，200 μM的NO清除剂PTIO处理使杜梨种子的萌发率始终低于对照，14 d时的萌发率仅有15.6%，与对照(21.1%)差异达到显著水平(P＜0.05)，说明打破杜梨种子休眠需要NO参与。经10 mM SNP和200 μM PTIO共同处理14 d时的发芽率只有35.6%，与10 mM SNP单独处理(55.7%)相比差异显著(P＜0.05)。可见NO可以打破杜梨种子休眠，提高种子萌发率。

图2 PTIO对杜梨种子休眠的影响Fig.2 Effect of PTIO on the dormancy of Pyrus betulifolia Bunge seeds

2.3 参与打破杜梨种子休眠的NO合成途径

在植物体内NO的合成途径包括NO合酶(NOS)途径、硝酸还原酶(NR)途径以及非酶促途径。为了研究在打破杜梨种子休眠中，NOS途径和NR途径是否参与，用NOS抑制剂L-NAME和NR抑制剂Na2WO4处理杜梨种子，结果如图3。从图3可以看出经L-NAME单独处理14 d时杜梨的萌发率仅仅是15.6%，为对照(22.2%)的70%，差异达到显著水平(P＜0.05)，可见NOS途径参与杜梨种子休眠的打破。经Na2WO4单独处理的种子在培养过程中的萌发率和对照相近，至第14天时的萌发率是23.3%与对照(22.2%)没有显著差别。可见NR途径没有参与杜梨种子休眠的打破。

3 讨论

图3 L-NAME和NA2WO4对杜梨种子休眠的影响Fig.3 Effect of L-NAME and Na2WO4on the dormancy of Pyrus betulifolia seeds

不同物种之间种子的休眠情况差别很大，习惯上把萌发率大于80%作为种子休眠打破的标志，也有的人以50%的萌发率作为标准［13］。种子休眠的原因多种多样，杜梨种子休眠是因为种子没有完成后熟。NO是近年研究比较多的气态小分子，大量的研究表明NO作为信号分子在植物生长发育和胁迫反应中起着重要作用。NO打破种子休眠促进种子萌发的报道也不少，但这些研究主要集中在需光种子的休眠方面，如NO可以代替光照打破泡桐［14］、拟南芥［15］和莴苣［16］等种子的休眠促进萌发，这表明NO作为信号分子能够打破光敏色素调节的休眠。SNP处理对黄色羽叶豆种子的萌发也有明显的促进作用，羽叶豆种子既没有休眠也不是需光种子［17］。2006年Zhang等发现在小麦种子萌发的早期阶段NO可以迅速增加β-淀粉酶的活性从而促进小麦种子的萌发［18］。可以看出NO在种子休眠和萌发中的作用似乎具有普遍性。2007年Agnieszka Gniazdowska等发现NO可以打破去皮的苹果种子的休眠，促进它的萌发［6］。杜梨和苹果同属蔷薇科植物，亲缘关系比较近，NO在杜梨种子中是不是也有同样的效果?本实验的结果证实了这一猜想。

从图1可以看出，不同浓度的SNP处理都有打破杜梨种子休眠的效应，并且表现为浓度依赖性，浓度越高萌发率越高，比如10mM SNP处理14 d时的萌发率可以达到56.7%，而5 mM SNP处理14 d时萌发率只有41.1%。NO不是SNP唯一的水解产物，为了确定打破杜梨种子休眠中是否NO在起作用，我们进行了药理学实验(图2)。在SNP的处理中加入NO清除剂PTIO处理后，可以逆转SNP的作用，14 d后只有35.7%种子萌发，与SNP单独处理相比差异显著。PTIO可以维持杜梨种子休眠抑制萌发，经PTIO单独处理14 d时种子的发芽率只有15.7%，与对照(21.1%)也有明显的差异。从实验结果我们可以得出结论NO可以打破杜梨种子休眠。

植物中NO的产生途径研究已经进行了20多年，前人研究表明，植物体内NO来源可能有3个:NOS途径、NR途径和非酶促合成途径。Ninnemann和Maier(1996)第一次明确阐述了豆科植物可以通过 NOS途径合成 NO［19］。随后的研究证明玉米［20，21］、拟南芥［22，23］、烟草［24］等许多植物中都存在NOS途径和NR途径。但是植物通过哪条合成途径调控种子休眠至今未见报道，Caro和 Pun-tarulo在1999年曾观察到在大豆种子的 NOS活性随萌发进程深入而上升［25］，这似乎暗示了在种子萌发过程中存在NOS合成途径。本实验中(图3)分别用200 μM的L-NAME和10mM的Na2WO4处理杜梨种子来研究NO通过哪条途径来调控种子休眠。图3表明L-NAME单独处理可以抑制杜梨种子萌发，14 d时种子的萌发率是15.7%，与对照(22.2%)差异显著。而Na2WO4处理效果不显著，14d时发芽率是23.3%与对照没有显著差异。结果证明在杜梨种子休眠打破时，NO的来源可能是通过NOS途径，而不是通过NR途径合成的。

由此可以得出结论:外源NO可以打破杜梨种子休眠，显著提高萌发率，其中10 mM是SNP处理的最佳浓度。在打破杜梨种子休眠中，NO合成有一氧化氮合酶(NOS)途径而没有硝酸还原酶(NR)途径参与。

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