六味地黄丸抑制移植性原发性肝癌小鼠肿瘤生长的实验研究

罗春蕾 顾怡中 钟 薏 周荣耀

(上海市静安区中心医院中医内科，上海 200040)

1 上海市普陀区中医医院老年科，上海 200062

2 上海中医药大学附属曙光医院肿瘤科，上海 200021

原发性肝癌(以下简称肝癌)是指发生在肝细胞或肝内胆管细胞的肿瘤，我国肝癌发病率居世界前列，以肝细胞癌为多，后者不足5%［1］。六味地黄丸是中医临床常用滋阴补肾的中药方剂，有研究表明其对肝癌的治疗也有显著疗效［2-3］。本实验观察六味地黄丸对移植性肝癌模型小鼠肿瘤细胞生长的影响，探讨其对肝癌的作用机制，以期为肝癌的中医药治疗提供客观依据。

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 动物 昆明种小鼠30只，雄性，体质量(20±2)g，无特定病原体(SPF)级条件下饲养，由上海中医药大学动物实验中心提供，购自上海斯莱克实验用动物责任有限公司，动物合格证号SCXK(沪)2009-0069。

1．1．2 试剂及仪器 腹水型肝癌 H22细胞株(中国科学院上海细胞库);血管内皮生长因子(VEGF)酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒(美国 R＆D公司);RPMI-1640培养液(美国Gibco公司);小牛血清(美国Hyclone公司);酶标仪(美国Biotek公司);流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)。

1．1．3 药物 氟尿嘧啶注射液(5-FU，上海旭东海普药业有限公司，国药准字H31020593)，超净工作台避光条件下，以无菌0．9%氯化钠注射液稀释至2 mg/mL，环氧树脂(EP)管分装，锡纸遮盖，保存于4℃冰箱。六味地黄丸药物组成:山药12 g，泽泻9 g，熟地黄12 g，山茱萸9 g，牡丹皮9 g，茯苓12 g。中药生药由上海中医药大学附属曙光医院中药房提供，采用标准水煎提取，制成汤剂，蒸馏提取至含生药2 mg/mL的水煎液，4℃冰箱保存备用。

1．2 实验方法

1．2．1 造模及分组 腹水型肝癌H22细胞株由上海中医药大学生化与分子生物学实验室完成预处理，接种于小鼠右前肢腋窝下，皮下注射种植。造模24 h后，将30只小鼠按随机数字表法随机分为模型组、5-FU组及实验组，每组10只，以苦味酸标记，分笼饲养，每笼5只，自由饮食。

1．2．2 给药方法 造模后第5 d给药，模型组和实验组小鼠按0．1 mL/10 g分别予蒸馏水及六味地黄丸汤剂灌胃，每日1次，连续灌胃10 d;5-FU组按照0．1 mg/10 kg予5-FU腹腔注射，隔日1次，治疗10 d。

1．3 观察指标及方法

1．3．1 肿瘤表观扩散系数(ADC) 各组小鼠造模后第14 d禁食1 d，第15 d称取体质量，予0．5%戊巴比妥钠0．1 mL/10 g腹腔注射麻醉，麻醉完成后进行核磁共振成像(MRI)检查。由2位MRI诊断专家采用双盲法测量各组小鼠ADC值，结合T1WI(T1加权像)及T2WI(T2加权像)，选取病灶最大层面，在ADC图上选取病灶实性部分，手工绘制椭圆形感兴趣区(ROI)，测量肿瘤实质部分的ADC值。若观测者测量结果出现较大分歧，另由1位高年资经验丰富的MRI诊断专家复核测量。

1．3．2 血清 VEGF 血清 VEGF的测定采用ELISA法。造模后第16 d，各组小鼠摘眼球取不抗凝血，血液样本于2 h内以5 000 r/min速度离心20 min，离心后去血清，-20℃保存。

1．3．3 体质量、去瘤体质量、肿瘤质量、肿瘤指数及肿瘤生长抑制率(抑瘤率) 各组小鼠体质量固定于每日给药前测定。各组小鼠摘眼球取血后脱颈椎处死，剖取瘤体，测定瘤体质量。去瘤体质量=处死前小鼠体质量-瘤体质量。肿瘤指数=瘤体质量/去瘤体质量。抑瘤率=［1-(用药组瘤体质量/模型组瘤体质量)］×100%。

1．3．4 肿瘤细胞凋亡及细胞周期检测 各组小鼠均取新鲜肿瘤组织0．5～1．0 g，由上海中医药大学生化与分子生物学实验室采用流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡百分比，观察细胞周期。

1．4 统计学方法 应用SPSS 16．0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差(¯x±s)表示，组间比较先采用方差分析进行显著性检验;多组样本均数间两两比较采用q检验;非参数检验采用χ2检验。

2 结果

2．1 各组小鼠体质量及去瘤体质量比较 见表1。

表1 各组小鼠体质量及去瘤体质量比较g，±s

表1 各组小鼠体质量及去瘤体质量比较g，±s

与模型组比较，*P ＜0．05;与5-FU 组比较，△P ＜0．05

组 别 n体质量第1 d 第5 d 第8 d 第16 d 去瘤体质量模型组 10 20．43 ±1．32 24．15 ±2．00 24．89 ±1．95 24．58 ±2．43 20．11 ±2．25 5-FU 组 10 20．57 ±1．39 24．23 ±1．48 25．99 ±1．11 28．65 ±3．49* 26．67 ±3．69*实验组 10 20．34±1．29 24．06±1．86 28．33±3．05＊△ 35．42±1．82＊△ 32．36±1．79＊△

由表1可见，造模后第8 d，实验组小鼠体质量均高于5-FU组及模型组(P＜0．05)，5-FU组与模型组体质量相当(P＞0．05);造模后第16 d，实验组及5-FU组小鼠体质量及去瘤体质量均高于模型组(P＜0．05)，且实验组比5-FU组高出更明显(P ＜0．05)。

2．2 各组小鼠肿瘤质量、肿瘤指数及抑瘤率比较见表2。

表2 各组小鼠肿瘤质量、肿瘤指数及抑瘤率比较

由表2可见，各组小鼠肿瘤质量及肿瘤指数比较，实验组均低于模型组(P＜0．05)，均高于5-FU组(P＜0．05)，各组组间比较差异均有统计学意义(P＜0．05);实验组与5-FU组抑瘤率比较，实验组低于5-FU组(P＜0．05)。

2．3 各组小鼠肿瘤细胞凋亡及细胞周期所占百分比比较 见表3。

表3 各组小鼠肿瘤细胞凋亡及细胞周期所占百分比比较%，±s

表3 各组小鼠肿瘤细胞凋亡及细胞周期所占百分比比较%，±s

与模型组比较，*P ＜0．05;与5-FU 组比较，△P ＜0．05

组 别 n 细胞凋亡细胞周期G0-G1期 S期 G2-M期模型组 10 3．628 ±2．150 46．13 ±6．39 38．61 ±8．43 15．27 ±7．11 5-FU 组 10 24．296 ±2．748* 70．77 ±13．21* 15．33 ±6．10* 13．62 ±7．95实验组 10 10．670±2．318＊△ 57．50±5．86＊△ 33．07±4．67△9．44 ±4．09

由表3可见，各组小鼠肿瘤细胞凋亡百分比比较，实验组高于模型组(P＜0．05)，低于5-FU组(P＜0．05)，各组组间比较差异均有统计学意义(P＜0．05)。各组小鼠细胞周期百分比比较，实验组G0-G1期细胞高于模型组(P＜0．05)，低于5-FU组(P＜0．05)，各组组间比较差异均有统计学意义(P＜0．05);实验组S期细胞高于5-FU组(P ＜0．05)，与模型组相当(P ＞0．05);各组G2-M期细胞组间比较差异均无统计学意义(P ＞0．05)。

2．4 各组小鼠血清VEGF水平及ADC值比较表4。

表4 各组小鼠血清VEGF水平及肿瘤ADC值比较 ±s

表4 各组小鼠血清VEGF水平及肿瘤ADC值比较 ±s

与模型组比较，*P ＜0．05;与5-FU 组比较，△P ＜0．05

组 别 n VEGF(pg/mL) ADC(mm2/s)模型组10 34．385 6 ±5．370 3 1421．058 ±159．903 5-FU 组 10 15．895 1 ±2．907 1* 743．777 ±104．882*实验组 10 18．725 4±0．936 8＊△ 940．376±124．263＊△

由表4可见，各组小鼠血清VEGF水平及ADC值比较，实验组均低于模型组(P＜0．05)，均高于5-FU组(P＜0．05)，各组组间比较差异均有统计学意义(P＜0．05)。

3 讨论

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，病因尚不完全清楚，易复发、转移，死亡率高。VEGF是迄今为止已知人体内最强的血管生成因子［4］，能直接或间接参与血管生成，大量临床研究显示，VEGF高表达与肿瘤恶性程度及患者预后不良密切相关［5］。因此，抗肿瘤血管生成药物的研制和应用广受国内外医药界关注，并有一些药物应势而生，但仍然存在一些问题不容忽视，因VEGF亚型较多，其作用机制尚未完全明晰，长期服用该类药物是否会造成其他难以估测的损伤尚不明确［4］。氟尿嘧啶在体内先转变为5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷酸，后者可抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧尿嘧啶核苷酸转变为脱氧胸腺嘧啶核苷酸，从而抑制DNA的生物合成，抑制肿瘤生长［6］。

影像学检查是肝癌动物模型实验的重要技术手段，弥散成像作为一种无创性成像技术，可根据组织的水分子张力差，别即扩散受限程度的不同进行成像，通过检测生物体内水分子运动状态的改变而间接反映组织结构和细胞密度等信息，提供的ADC值能消除T2穿透效应，提供量化指标，从分子水平分析组织内部特征以及对治疗的反应［7］。肿瘤细胞增生活跃时，细胞、血管外周间隙增大，水分子扩散受限较低，故表现出较高的ADC值;而细胞发生凋亡时，胞浆浓缩，细胞固缩，细胞外周间隙相对偏小，水分子自由扩散受限较高，表现出较低的ADC值。

中医学认为，肝癌之病位在肝，常累及周身。肝、肾母子相生，精血同源，且同寄相火，藏泻互用，一者为病，常累及余者。又肾为先天之本，乃脏腑阴阳之根本，古有“久病及肾”之说，肝、肾功能息息相关，一荣俱荣，一辱俱辱，故在治法上有“乙癸同源，肝肾同治”之说，发展至今，于临床广为应用［8-9］。六味地黄丸为肝、肾同治的代表方。宋·钱仲阳论“肾主虚，无实也”，以肾气丸裁桂枝、附子，成六味地黄此通补开阖之剂，大补肝、脾、肾，用治各类疾病过程中出现的肾阴亏损，或肝肾不足之证。六味，即苦、酸、甘、咸、辛、淡者也。熟地黄味苦，入肾，大补肾之精血，固封蛰之本;山茱萸味酸，入肝，补肝固精，缓罢极之牢;山药味甘，入脾，健脾助运。此3味以后天之精助先天之用，谓曰“三补”。古人用补，必兼泻邪，邪去则补方得力。方中“三泻”即指泽泻、牡丹皮、茯苓。泽泻味咸，入膀胱，泄肾浊，兼制熟地黄之滋腻，开气化之源，助熟地黄填少阴、太阳之精;牡丹皮味辛，入胆，清中正之气，制山茱萸之温，佐其补厥阴、少阳之精;茯苓味淡，入胃，利出入之器，渗脾利湿，以助山药养脾阴，补太阴、阳明之精。三补三泻合用，通方滋而不腻，相和相济，不燥不寒，清·张秉成谓之曰“王道之方”。临床研究表明，六味地黄可应用于肿瘤患者的放化疗、手术前后、内分泌治疗等多个阶段，具有减毒、增效作用，可协同抑制肿瘤细胞生长和扩散，提高患者生活质量，调节机体免疫功能［10］。

本研究结果显示，六味地黄丸可抑制肝癌小鼠肿瘤生长，对于细胞周期亦有影响，可促进肿瘤细胞凋亡，促使G0-G1期细胞聚集，减少S期细胞，干扰了小鼠肝癌细胞在细胞周期中的进程，鉴于细胞周期的调控复杂未明，因此具体的作用机制仍有待探究。六味地黄丸可抑制血清VEGF的表达，降低肿瘤ADC值，提示其抗癌作用可能与下调VEGF水平相关。综上所述，六味地黄丸可明显抑制肝癌小鼠瘤体生长，影响瘤体细胞周期，诱导小鼠肝癌细胞凋亡，降低血清VEGF水平，降低肿瘤ADC值，从而产生良好的抗肿瘤作用。

［1］ 王吉耀．内科学(上册)［M］．北京:人民卫生出版社，2008:513．

［2］ 周斌，曾柏荣．六味地黄丸在肿瘤治疗中的作用［J］．肿瘤基础与临床，2010，23(1):91-93．

［3］ 任怡．六味地黄汤对小鼠原发性肝癌模型的作用机制研究［J］．湖南中医杂志，2013，29(2):124-126．

［4］ 邹文员，张自力．血管内皮生长因子与原发性肝癌血管新生关系及抗血管治疗的进展［J］．放射学实践，2009，24(3):338-339．

［5］ 罗春蕾，周荣耀．补肾健脾方治疗肝肾阴虚兼脾气虚肝癌30 例［J］．中医研究，2010，23(6):30-32．

［6］ 高君，程研，孔健，等．氟尿嘧啶植入剂对H22肝癌移植瘤射频消融后残留癌的抑制作用及其机制［J］．中华实验外科杂志，2011，28(8):1299-1302．

［7］ 汪洋，林从尧，周夏．大肠癌中β-catenin表达及与COX-2、VEGF表达的关系［J］．肿瘤防治研究，2006，33(1):20-22．

［8］ 张怡．原发性肝癌与脾肾关系之病机浅探［J］．新中医，2011，43(2):4-5．

［9］ 谭程，李晓君．肝肾相关的病机及治疗规律探讨［J］．北京中医药大学学报:中医临床版，2007，14(2):28-30．

［10］ 周斌，曾柏荣．六味地黄丸在肿瘤治疗中的作用［J］．肿瘤基础与临床，2010，23(1):91-93．