酒石酸钾钠双水相体系分离纯化C-藻蓝蛋白

赵 丽 , 彭一良, 康 天, 蔡伟民

(1. 哈尔滨工业大学 市政环境工程学院, 黑龙江 哈尔滨 150080； 2. 哈尔滨师范大学 生命科学与技术学院,黑龙江 哈尔滨 150025)

双水相(Aqueous two-phase systems, ATPS)是一种新型的分离纯化技术[1]。体系中的两相都是水溶液,操作条件温和[2], 系统的含水量高达 75%～90%, 为亲水性很强的生物物质提供了适宜的环境, 而且不会引起生物物质的失活和变性。因此, 双水相技术已广泛的应用于生物化学、细胞生物学、生物化工等物质分离提纯领域[3-4]。但由于传统双水相的原料聚乙二醇和葡聚糖成本太高, 目前真正工业化的例子还很少。

藻蓝蛋白(C-phycocyanin, C-PC )是一种水溶性蓝色荧光蛋白, 广泛存在于蓝藻中。C-PC一般由等摩尔的α 和β亚基聚合构成, 每个α亚基或β亚基含有至少 1个直链四吡咯化合物的藻胆素(Phycobilins)发色团[5], 使C-PC呈现鲜亮的蓝色, 因此C-PC常作为天然色素应用于食品、添加剂和化妆品领域[6]。此外, 由于C-PC还具有高效的荧光特性,也广泛应用于医药保健领域、化学光敏剂, 以及荧光分析等领域[7]。藻蓝蛋白纯化工艺复杂、成本高、步骤繁多、回收低, 导致天然藻蓝蛋白的市场价格高达50美元/mg[8]。螺旋藻是国内外的一种经济型蓝藻,年产高于2 000 t。螺旋藻的蛋白质含量可达干重的70%以上, 其中, 藻蓝蛋白的含量超过 20%[9], 因此,常被作为提取C-PC的首选蓝藻。国内、外通常采用新鲜的螺旋藻作为提取原料。近年来, 国内已开始选用干藻粉作为提取C-PC原料。

分离纯化藻蛋蓝白的主要方法是进行多级色谱柱层析[10-11]。其操作步骤繁多、产量少[12-13], 不适合于工业化生产。近年来, 双水相萃取分离技术已开始被应用于藻蓝蛋白的分离纯化。国外学者应用PEG4000/磷酸钾体系[14], 获得了藻蓝蛋白的高纯度。但 PEG4000黏度较高, 分相时间较长, 而且C-PC富集于 PEG4000中, 高黏度增加了PEG去除的难度。国内学者应用PEG2000/硫酸铵双水相体系获得藻蓝蛋白[15], 但最终纯度较低仅达到1.2。

本文采用廉价的PEG1000/酒石酸钾钠双水相体系, 分离纯化 C-PC, 有效降低了体系黏度。研究双水相分离纯化规律, 分析分离萃取过程中, 各种条件因素的影响情况及相互作用关系, 从而优化双水相体系参数。实现高效、低成本、易操作的藻蓝蛋白提取, 为藻蓝蛋白能够得到广泛应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

干螺旋藻藻粉购买于中国海洋大学生命科学学院。

聚乙二醇、磷酸盐、硫酸铵、酒石酸钾钠等(分析纯)购买于国药集团化学试剂有限公司。UV-2102 PC型紫外-可见光分光光度计, 中国上海尤尼克公司； 台式高速冷冻离心机(TGL-16MI)长沙湘麓离心机有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藻蓝蛋白的粗提液

准确称取6 g干螺旋藻藻粉, 溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液, 混合均匀。采用反复冻融法： -20℃冷冻,室温融化, 反复冻融6次。10 000 r /min 离心10 min,收集上清液, 4℃保存备用。

1.2.2 双水相体系

选择PEG /盐双水相体系。其中盐溶液分别为磷酸钾, 磷酸钠, 硫酸铵, 酒石酸钾钠。绘制体系相图,根据相图计算配比, 选取不同体系组成。将不同配比与粗提液混合均匀, 4℃静置, 分别记录上、下相分层情况, 上、下相体积, 取少量待测。

1.2.3 双水相系统参数

纯度[12-14,16-17](P)： 目的蛋白在620 nm处的特征吸光值和总蛋白在280 nm处吸光值的比值。

纯化因子(F)： 目的产物提纯后的纯度与粗提液纯度的比值。

分配系数(K)： 目的蛋白在上相和下相浓度的比值。C-PC易富集于上相PEG中。实验证明它在上相的浓度为0.1 g/L时, 在下相浓度是接近0.0 001 g/L。因此下相C-PC的浓度可忽略。

系线长(TLL)： 双水相系统的上相和下相的浓度总组成的关系。它通常反应了ATPS系统构成对分离材料的影响效果。

体积比(Vr)： 体系上相和下相的体积比。

1.2.4 多次双水相

取一定量的上一次 ATPS获得的 PEG溶液, 按照一定的配比与一定量的同种盐溶液混合均匀, 4℃静置, 分别记录上、下相分层情况, 上、下相体积, 取少量待测。其他参数保持和一次ATPS一致。

1.2.5 分析方法

采用紫外-可见光分光光度计对上相溶液进行全波长扫描, 起始波长260 nm, 终止波长700 nm。记录不同波长处的吸光值。

采用荧光发射光谱测定C-PC的活性。荧光发射光谱的激发波长为560 nm。扫描范围由580 nm到770 nm。

数据分析运用ORIGN 8.5, MATLAB R2008a。

2 结果与分析

2.1 螺旋藻藻粉的细胞学形态

光学显微镜下观察螺旋藻的细胞学形态(10倍)见图1。可见藻段呈螺旋状。C-PC粗提液纯度为0.42。

图1 螺旋藻藻粉的细胞学形态Fig. 1 The morphology of the dry spirulina platensis powder

2.2 不同盐相对C-PC纯度的影响

在TLL为27%±1%、Vr为1, PEG分子质量一定的情况下, 比较不同的盐相(磷酸钠、磷酸钾、酒石酸钾钠、硫酸铵)对C-PC纯度的影响, 结果见图2。C-PC的等电点为 4.0。硫酸铵、磷酸钠、磷酸钾、酒石酸钾钠构成的双水相体系的 pH均超过等电点(pH分别为 4.80、5.85、6.80、8.06)[16], 理论上这四种盐都适合C-PC的提取。因为盐相中正负离子的存在, 对体系中分子具有不同的亲和力, 并产生电位差, 因此, 选择最佳的盐相对 C-PC的提纯非常重要。PEG分子质量从1 000到4 000的各双水相体系中, 酒石酸钾钠构成的双水相体系对C-PC提取效果最好。可能是因为酒石酸钾钠可以更好的改变蛋白质的疏水性和相间电位的程度, 从而影响蛋白质解离基团的解离度, 提高了 C-PC在上相 PEG中的富集。所以选择酒石酸钾钠作为盐相, 进行后续试验。

图2 不同盐相对C-PC纯度的影响Fig. 2 The influence of different salts phase on the purity of C-PC

2.3 不同PEG分子质量对C-PC纯度的影响

在Vr为1,TLL为21.65% 的PEG /酒石酸钾钠双水相体系中, 比较不同的PEG分子质量(1 000、1 500、2 000、4 000), 对C-PC纯度的影响, 以C-PC纯度为纵坐标, PEG分子质量为横坐标, 结果见图3。PEG 1 000体系提取效果最好。在图 2中,TLL为27%±1%时, 也得到同样的结果： PEG 1000体系提取效果最好。PEG分子端具有很多游离的具有一定亲水性的羟基。在PEG相组成一定时, PEG分子质量的增加, 分子链长增加, 双水相体系中游离羟基的数量减少, 分子内极性基团的比重相对降低, 极性减小, 从而富含PEG的上相的亲水性减小。C-PC是一种高亲水性蛋白, 低分子质量的 PEG有利于亲水性的C-PC到达富含PEG的上相。此外, PEG分子质量的减小, 会使体系黏度降低, 空间阻力减小, 界面张力减小, 蛋白在相间的传递及在相中的扩散阻力大大减小, C-PC分子远离界面, 更易进入上相PEG, 从而导致C-PC纯度增加。PEG 1 000的提取效果最好, 基本符合了分子质量越低越利于蛋白质富集的规律。

图3 体系PEG分子质量对C-PC纯度的影响Fig. 3 The influence of PEG molecular weight on the purity of C-PC

2.4 TLL对C-PC纯度的影响

TLL是双水相体系组成的关键因素, 其中的每个点都代表着不同 PEG和盐的质量分数的组成成分。分子质量高于10 000 亲水性蛋白, 比较容易进入TLL小于 40%(质量分数)的双水相体系[18]。因此在PEG1 000和酒石酸钾钠双水相体系中, 选择中、短的TLL(质量分数)： 14.66%、21.65%、26.51%、30.26%、33.47%。在Vr一定的情况下, 比较不同TLL对C-PC纯度的影响, 以C-PC纯度为纵坐标,Vr为横坐标, 结果见图4。C-PC的纯度与TLL呈现负相关。当Vr一定时, C-PC的纯度随TLL的增加, 呈下降趋势,即TLL越大, C-PC的纯度越低。TLL为14.66%时, 其C-PC的纯度虽然最高, 但其相分离的时间很长, 因为TLL越小, 越接近双结线, 越接近临界值。TLL为21.65%时, 其C-PC的纯度仅略低于TLL为14.66%, 但相分离的时间较短, 因此, 选择TLL为21.65%继续试验。

图4 TLL对C-PC纯度的影响Fig. 4 The influence of TLL on the purity of C-PC

2.5 不同Vr对C-PC纯度的影响

Vr对C-PC纯度的影响非常显著。在TLL一定的情况下, 比较不同的上、下相体积比Vr对 C-PC纯度的影响。以C-PC纯度为Z轴坐标,Vr为Y轴坐标,TLL为X轴坐标, 结果见图5。C-PC的纯度与Vr呈现负相关。当TLL一定时, C-PC的纯度随着Vr的减少, 呈上升趋势即Vr越小, C-PC的纯度越高。在TLL为21.65%,Vr为 0.22时, C-PC的纯度最高达到1.27。Vr变小, 即上相体积减少, 使上相可利用空间减少, 总蛋白的空间变小, 非目的蛋白随着下相体积的增大, 更多分配到下相, 目的蛋白C-PC的纯度提高。其他藻也表现出相同的分离行为[8]。但是与PEG4000提取新鲜螺旋藻[14]表现出行为正好相反。可能是因为 PEG的分子质量的增大, 影响了双水相体系的疏水性。

图5 Vr对C-PC纯度的影响Fig. 5 The influence of Vr on the purity of C-PC

2.6 不同TLL和Vr对C-PC回收率的影响

不同的TLL和不同的Vr对C-PC回收率的影响。以C-PC回收率为Z轴坐标,Vr为Y轴坐标,TLL为X轴坐标, 结果见图6。Vr对C-PC回收率的影响非常显著。在不同的TLL中, 回收率和Vr呈现明显的正相关, 随Vr的减少, 回收率呈下降趋势。在TLL33.47%,Vr 2.11处C-PC的回收率最高达到95.64%。在体系获得最高纯度 1.27, 回收率为 85.11%。虽然体系对C-PC的最大回收率在TLL为33.47%处获得,但当Vr一定时,TLL对回收率的影响并不显著。所有配比的回收率均高于85%。

图6 系统TLL和Vr对C-PC回收率的影响Fig. 6 The influence of TLL and Vr on the yield of C-PC

2.7 不同相组成质量分数对 C-PC纯度的影响

分别在不同TLL上选取不同PEG1 000和酒石酸钾钠相组成配比建立双水相体系, 确定最优组成。以C-PC纯度为Z轴坐标, PEG1 000质量分数为Y轴坐标, 酒石酸钾钠质量分数为X轴坐标, 结果见图7。PEG1000和酒石酸钾钠构建的双水相体系的质量分数分别为7.76%和21%, pH 8.06, 系线长21.65%、体积比 0.22纯化效果最佳, 纯度由 0.42提高到 1.27,纯化因子3.04, 回收率85.11%。

图7 相组成浓度对纯度的影响Fig. 7 The influence of components in the ATPS on the purity of C-PC

2.8 多次ATPS对纯度的影响

硫酸铵盐析法, 提高粗提液纯度达到1.46。选择上述最优条件, 建立 PEG/酒石酸钾钠双水相体系。按照一次ATPS配比, 建立多次ATPS。以纯度作为Z轴坐标, 双水相体系萃取(ATPE)的次数作为X轴坐标, 结果见图8。2次ATPE萃取获得最高纯度3.28,明显高于1次、3次和4次ATPE的萃取结果。

2.9 C-PC的吸收光谱

图8 多次ATPS对C-PC纯化因子的影响Fig. 8 The influence of multiple ATPE stages on the purity of C-PC

采用紫外-可见光分光光度计对硫酸铵盐析、2次 ATPS提取的 C-PC进行全波长扫描, 起始波长260 nm, 终止波长700 nm, 结果见图9。

图9 C-PC的吸收光谱Fig. 9 The absorption spectrum of the recovery C-PC

2.10 C-PC的荧光测定

测定2次ATPS提取的C-PC的荧光光谱, 结果见图10。C-PC具有荧光, 峰值在643 nm获得。经过ATPS萃取提纯的C-PC, 具有荧光, 在643 nm处获得峰值, 相对荧光强度 155.5, 具有的很好的生物活性。

图10 C-PC的荧光发射光谱Fig. 10 The fluorescence emission spectrum of the recovery C-PC

3 结论

采用廉价的 PEG1000/酒石酸钾钠双水相体系,从干螺旋藻中分离纯化 C-PC。实验结果表明, 双水相体系浓度为 7.76% (w/w)的 PEG1000、21%(w/w)的酒石酸钾钠、TLL为21.65%、Vr为0.22, pH为 8.06时, 蛋白的纯度为1.27, 回收率为85.11%。硫酸铵盐析法提高粗提液纯度, 经过2次ATPS, C-PC纯度可提高到3.28, 高于药品级3.0。获得的 C-PC具有荧光, 生物活性良好。

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