生防细菌K2-1对大菱鲆病原菌的抑制作用及其抗菌特性分析

方卫东 , 唐 旭 刘源森 林 凌 黄仕新 徐长安

(1. 国家海洋局 第三海洋研究所 福建 厦门 361005； 2. 集美大学 水产学院 福建 厦门 361005)

大菱鲆(Scophthalmus maximus)属鲽形目(Pleuronectiformes)、鲆科(Bothidae)、菱鲆属(Scophthalmu), 是产于欧洲的一种冷水性海产鲆鲽类[1], 山东是中国大菱鲆的主要养殖区, 居全国首位, 并带动了辽宁、河北、天津、江苏等地的大菱鲆养殖的发展[2-3]。然而随着养殖规模不断扩大、水资源缺乏、长期使用抗生素造成耐药性的产生, 养殖病害发生率逐年提升, 给养殖业带了巨大的损失[4]。研究表明：生物防治技术是解决养殖病害的有效措施之一。蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)已被越来越多地研制成饲用微生态制剂, 其在促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率和防病促生长等方面起到重要作用[5]。另外, 研究还表明蜡状芽孢杆菌可以提高对虾育苗的出苗率, 减少疾病的发生并提高产量[6]。本实验室筛选到一株蜡状芽孢杆菌 K2-1, 其发酵产物对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)有很强的抑制作用,本研究探讨了蜡状芽孢杆菌K2-1的发酵产物对大菱鲆养殖常见致病——菌副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、爱德华氏菌(Edwardsiella)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的抑制效果,并考察分析蜡状芽孢杆菌 K2-1 抗菌物质的部分特性, 初步评估该菌株的使用价值。

1 材料与方法

1.1 菌株

K2-1是本实验室分离自福建省厦门市海沧港口污泥, 根据形态学观察、生理生化特性和16S rDNA分析, 鉴定其为蜡状芽孢杆菌。

1.2 测试菌和指示菌

测试菌为大菱鲆养殖常见致病菌, 包括副溶血弧菌、爱德华氏菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌, 这些测试菌由青岛农业大学从当地的大菱鲆养殖场病鱼中分离获得, 保藏工作正在进行中,实验室攻毒试验表明, 测试菌毒力较强； 指示菌为溶藻弧菌, 由福建师范大学教育部工业微生物重点实验室提供。

1.3 培养基

LB培养基： 蛋白胨10 g, 酵母提取物5 g, NaCl 10 g , pH 7.3, 水1 000 mL。

SLB培养基： 蛋白胨10 g, 酵母提取物5 g, NaCl 10 g, 琼脂20 g, pH 7.3, 水1 000 mL。

1.4 仪器设备

常规玻璃器皿、电子天平、超净工作台、打孔器、移液枪、台式摇床、高压蒸汽灭菌锅、酶标仪、恒温培养箱等。

1.5 抑菌效果检测

采用琼脂扩散法进行测定[7]。通过测量圆形的透明带(抑菌圈)直径的大小来表示发酵上清抑菌活性的强弱。

1.5.1 抑菌板制作

选择大菱鲆常见致病菌——副溶血弧菌、爱德华氏菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌, 用接种环刮下菌体接种至装有5 mL LB培养基的试管中, 放入温度设置为 37 ℃, 转速为 180 r/min的摇床中培养16 h后, 取1 mL的培养液至100 mL的45～50 ℃的SLB培养基中, 迅速摇匀, 倒板, 待凝固后, 每个抑菌板打6个孔。

1.5.2 发酵上清的制备方法

用接种环刮下K2-1菌体接种至装有7.5 mL LB培养基的试管中, 放入温度设置为 37 ℃, 转速为180 r/min的摇床中活化6 h后, 倒入150 mL的LB培养基中, 放入温度设置为37 ℃, 转速为180 r/min的摇床中发酵15 h, 取发酵液, 经10 000 r/min, 6 min离心后, 再经0.22 μm两次过滤, 去除菌体得发酵上清。

1.5.3 抑菌效果检测

每个抑菌板的3个孔加入50 μL的发酵上清, 另外3个孔加50 μL未接种的LB培养基为空白对照,然后置于37 ℃生化培养箱中培养, 观察、测量抑菌圈直径, 并进行统计学分析。

1.6 抗菌物质的初步鉴定

将K2-1在上述LB培养基中发酵12h, 制得上清液, 上清液用饱和度为 60%的硫酸铵溶液沉淀,离心后得沉淀物和离心液, 对沉淀物进行透析除盐,所得透析液与离心液分别用上述琼脂扩散法检测抑菌活性并比对抑菌能力, 初步检测抗菌物质是否含有蛋白(肽)类成分。

1.7 抗菌物质部分特性分析

[8～13], 以福建师范大学教育部工业微生物重点实验室提供的溶藻弧菌为指示菌, 考察不同的发酵时间、温度、酸碱度(pH值)、紫外线、蛋白酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶 K、木瓜蛋白酶)对发酵上清抑菌活性的影响, 每个水平设定3个重复。

1.7.1 发酵时间对抑菌效果的影响

发酵时间设定 4、8、12、16、20、24、28 h , 每个时间点取发酵上清, 按照1.5的方法检测发酵液的抑菌效果, 并同时用比浊法测定K2-1菌液的OD600,绘制生长曲线。

1.7.2 发酵上清对温度的耐受分析

发酵上清分别在温度设定为： 40、50 、60 、70 、80 、90 ℃的水浴锅中水浴加热10 min, 按照1.5的方法检测其抑菌活性。

1.7.3 发酵上清对pH值的耐受分析

发酵上清分别在 pH值为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0, 处理发酵上清3 h, 然后调回原值, 并稀释至同体积, 避免浓度的影响, 且以未用酸碱处理的发酵上清作为对照(pH值为7.3)。并按照1.5的方法检测其抑菌活性。

1.7.4 发酵上清耐受紫外线照射分析

发酵上清分别在紫外线下照射10、20、40、60 min,且以未进行紫外线照射的发酵上清为对照。并按照1.5的方法检测其抑菌活性。

1.7.5 发酵上清对蛋白酶的敏感性分析

分别选取胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶(4种酶质量浓度均为1 g/L)在37 ℃水浴条件下与发酵上清进行酶解反应4 h后, 在70 ℃下水浴30 min,灭活各蛋白酶, 并按照1.5的方法检测其抑菌活性。

1.8 数据处理

采用SPSS11.5 软件进行相关数据的处理和分析。

2 结果与分析

2.1 蜡状芽孢杆菌K2-1对大菱鲆常见致病菌的抑制效果

拮抗实验结果表明： 如表1及图1～图5所示, 蜡状芽孢杆菌K2-1对大菱鲆养殖常见致病菌, 包括副溶血弧菌, 爱德华氏菌, 哈维氏弧菌, 嗜水气单胞菌,溶藻弧菌均有较强的抑制作用, 其中对嗜水气单胞菌的抑制作用最强。

2.2 抗菌物质初步鉴定结果

发酵液经离心及过滤去菌体、盐析、透析后, 离心液和透析液以溶藻弧菌为指示菌, 在同一个培养板中进行抑菌活性检测, 抑菌结果如图6所示, 可以明显看出, 透析液的抑菌圈最大, 且明显大于离心液的抑菌圈, 原因是透析液浓缩了抗菌蛋白。基于硫酸铵对蛋白质的特异性沉淀性质, 可以判断, 抗菌物质含有蛋白(肽)类成分, 至于发酵上清中是否还含有其它非蛋白(肽)类的抗菌物质, 则还需进一步进行实验分析。

表1 蜡状芽孢杆菌 K2-1发酵上清对大菱鲆常见致病菌的抑制效果Tab. 1 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against selected pathogens of Scophthalmus maximus

图1 K2-1发酵液对副溶血弧菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against Vibrio parahaemolyticus

图2 K2-1发酵液对爱德华氏菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against Edwardsiella

图3 K2-1发酵液对哈维氏弧菌的抑菌效果Fig.3 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against Vibrio harveyi

图4 K2-1发酵液对嗜水气单胞菌的抑菌效果Fig.4 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against Aeromonas hydrophila

图5 K2-1发酵液对溶藻弧菌的抑菌效果Fig.5 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against Vibrio alginolyticus

图6 透析液和离心液的抑菌圈Fig. 6 Inhibition zone of dialysate and centrifugation.

2.3 抗菌物质部分特性分析结果

2.3.1 不同发酵时间对 K2-1菌株抗菌物质产量的影响

选用LB培养基, 在37 ℃, 180 r/min条件下发酵 4 h开始取样, 以后每隔4 h取样1次, 检测发酵上清的抑菌活性和测定 K2-1的生物量, 结果如图 7所示, 从图中可以看出, 8 h出现抑菌活性, K2-1处于指数生长期, 发酵12 h抑菌活性达到最强, K2-1进入平台期, 随着发酵时间的延长, 抑菌活性逐渐减弱, 当发酵时间到达24 h时, K2-1进入衰亡期, 发酵上清的抑菌活性也逐渐减弱, 表明K2-1发酵过程生物量与发酵上清抑菌活性存在正相关。

图7 不同发酵时间对K2-1菌株抗菌活性及生物量的影响Fig. 7 Effect of fermentation time on the antibacterial activity and biomass of strain K 2-1

2.3.2 不同温度处理对发酵上清中抗菌物质活性的影响

选用LB培养基, 在37 ℃、180 r/min条件下发酵 15 h, 所得发酵上清分别在温度为40、50、60、70、80、90 ℃的水浴锅中水浴加热10 min后检测抑菌活性, 结果如图8所示, 在50 ℃保持较好的抑菌活性, 60 ℃时抑菌活性开始下降, 70 ℃时抑菌活性有明显下降, 90 ℃时无抑菌活性, 结果表明抗菌物质具有一定的耐热性。

图8 不同温度处理对K2-1发酵上清抗菌活性的影响Fig.8 Effect of heat treatment on the antibacterial activity of strain K 2-1 supernatant

2.3.3 pH值对 K2-1发酵上清中抗菌物质活性的影响

选用LB培养基, 在37 ℃, 180 r/min条件下发酵 15 h, 所得发酵上清用HCl、NaOH调整pH值分别为： 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0, 处理 3 h后检测抑菌活性, 结果如图9所示, pH对K2-1发酵上清抑菌效果略有影响, 在酸性条件下抑菌效果略差, 但抑菌效果保持在较好的水平(抑菌圈均达到19.50以上)； 在中性或弱碱性的条件下抑菌效果最好, 随着碱性提高, 抑菌效果也随着下降, 显示发酵上清中的抗菌物质, 耐酸碱能力较强。

图9 pH对K2-1发酵上清抗菌活性的影响Fig.9 Effect of pH on the antibacterial activity of strain K 2-1 supernatant

2.3.4 不同紫外线照射时间对 K2-1发酵上清中抗菌物质活性的影响

选用LB培养基, 在37 ℃、180 r/min条件下发酵 15 h, 得发酵上清, 发酵上清在紫外线波长365 nm、距离10 cm下分别照射10、20、40、60 min后, 检测抑菌活性, 结果如图 10所示, 发酵上清中的抗菌物质对紫外线不敏感, 不同照射时间对抑菌效果影响差异不明显(P＞0.01), 照射后的发酵上清仍保持较好的抑菌效果。

图10 不同紫外线照射时间对K2-1发酵上清的抗菌活性的影响Fig. 10 Effect of UV treatment on the antibacterial activity of strain K 2-1 supernatant

2.3.5 不同蛋白酶对 K2-1发酵上清中抗菌物质活性的影响

选用LB培养基, 在37 ℃、180 r/min条件下发酵 15 h, 得发酵液, 分别选取胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶(4种酶浓度均为1 g/L)在37 ℃水浴条件下与发酵上清进行酶解反应4 h后, 在70 ℃下水浴30 min灭活各蛋白酶, 取出检测抑菌活性。结果如图 11所示, 可以看出, 发酵上清中的抗菌物质对胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶不敏感, 均保持较好的抑菌效果, 而对蛋白酶K敏感。

图11 不同蛋白酶对K2-1发酵上清的抗菌活性的影响Fig. 11 Effect of enzymatic treatment on the antibacterial activity of strain K 2-1 supernatant

3 讨论

目前食品安全备受关注, 作为一类重要的生防细菌, 芽孢杆菌在水产养殖中广泛使用, 也取得了很好的效果, 如芽孢杆菌能较好地降解亚硝酸盐[13]；巨大芽孢杆菌SZ-3对污染水体中的亚硝酸盐具有较强的降解效果[14]。另外研究表明某些芽孢杆菌在拮抗水产病原菌方面也有良好的效果, 如海洋生境枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)LHB02发酵产物对海水养殖常见致病菌弧菌有很强拮抗能力[10]； 短小芽孢杆菌 X93菌株, 其胞外产物对病原弧菌、迟缓爱德华菌和嗜水气单胞菌等水产上常见的主要致病菌具有很好的抑制效果[8]。蜡状芽孢杆菌在植物病害防治方面有明显的效果, 如蜡状芽胞杆菌N5对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、青枯假单胞杆菌(Pseudomonas solanacearum)等多种细菌和黄绿青霉(Penicillium)、炭疽菌(Colletotrichum)等多种真菌均表现出较好的抑菌活性, 抑菌谱更广[15]。本实验室筛选到的蜡状芽孢杆菌 K2-1 对大菱鲆养殖中常见的致病菌包括副溶血弧菌、爱德华氏菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌都有很强的抑制作用, 显示出较广的抑菌谱。

抗菌活性物质的产生除了与菌体本身的特性外,还受到培养基、发酵时间、发酵温度、pH值、接种量和装瓶量等因素的影响。其中发酵时间的控制至关重要, 发酵时间过短, 抗菌活性物质产量少, 发酵时间过长, 抗菌活性物质也随之降低。然而发酵时间也是影响发酵成本的主要因素之一, 当抗菌活性物质达到高峰时的发酵时间越短, 则成本越低。许多研究表明, 一般发酵时间在32 h以上抗菌活性物质才能达到高峰, 如健康刺参肠道的益生菌—枯草芽孢杆菌(菌种保藏号为 CCTCC M2010316), 发酵时间32 h抑菌效果最佳[16]； 交替单胞菌 YTW-10发酵时间36 h抑菌效果最佳[17]； 枯草芽孢杆菌B2发酵时间36 h抑菌效果最佳[18]； 枯草芽孢杆菌G发酵38 h抑菌效果最佳[19]； 拮抗链霉菌No.2发酵时间96 h抑菌效果最佳[20]。本实验室所分离的蜡状芽孢杆菌K2-1发酵时间 12 h, 抗菌活性物质达到高峰, 因此可以大幅度的降低发酵成本, 有利于该菌的开发利用。

蜡状芽孢杆菌 K2-1发酵上清在 40～70 ℃下保持较好的抑菌效果, 对酸碱度有较强的耐受性, 以及对多数蛋白酶不敏感, 特别是对胃蛋白酶不敏感,提高了该菌株抗菌物质应用的可行性, 如制备成生物抗生素, 利用其抵抗胃蛋白酶和胃酸的特性, 给药进入动物消化道, 用于动物肠炎的防治。

K2-1所具有的对大菱鲆致病菌较强的抑制作用,以及抗菌活性物质发酵生产时间较短, 耐受环境条件较强, 赋予了该菌株具有较好的开发应用前景,下一步, 本实验室将开展K2-1的发酵条件优化及活性产物的分离提取制备研究, 并开发基于该菌株的微生物杀菌剂及生物抗生素。

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