温度和光照对三角褐指藻的生长及岩藻黄素含量的影响

臧正蓉 , 解修俊 赵佩佩 , 郇 丽 , 黄爱优 张宝玉 潘光华 王广策

(1. 中国科学院海洋研究所, 山东 青岛 266071; 2. 中国科学院大学, 北京 100049; 3. 天津科技大学, 天津300457)

岩藻黄素(fucoxanthin)是一种类胡萝卜素, 在自然界中含量丰富, 尤其是在海洋环境中广泛存在[1]。在细胞中, 岩藻黄素与叶绿素a和叶绿素c组成捕光复合物, 作为捕光复合体[2]。有些藻类如甲藻和硅藻[3-4],由于其岩藻黄素的存在而呈特征性棕黄色。因此, 岩藻黄素有重要的研究意义。

研究发现, 岩藻黄素有许多显著的功效, 如抗氧化作用[5-6]、抗肿瘤作用[7-9]、抗癌作用[10-11]、皮肤保护作用[12]、抗血管生成作用[13]、脑血管保护作用[14]和预防骨质疏松作用[15]等。因此, 岩藻黄素应用广泛。尤其是近年来, 研究发现, 岩藻黄素有减肥作用[16-17]、降糖作用[17-18]和降脂作用[19-20]。进一步表明, 岩藻黄素有很高的应用价值。

目前, 可用于提取岩藻黄素的原料有很多, 如褐藻、硅藻等藻类。最早的原料主要是大型海藻, 包括海带(Laminaria japonica)、羊栖菜(Sargassum fusiforme)和裙带菜(Undaria pinnatifida)等[21]。然而,采用大型海藻提取岩藻黄素, 存在许多问题。一方面,大型海藻养殖成本高且有季节性生长的特点。另一方面, 大型海藻的岩藻黄素仅存在于表面的皮层细胞, 因而含量低, 并且大型海藻在新鲜和干燥条件下岩藻黄素含量不同。这些问题限制了岩藻黄素的开发利用。除大型海藻外, 海洋微藻中的岩藻黄素含量也很多。单细胞微藻具有生长速度快、易于培养和在生物反应器中可人工调控的优点, 从而解决了工业化生产的原料问题。

在培养单细胞微藻中, 为了解决生物量和岩藻黄素含量的问题, 作者以三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)为研究对象进行研究。三角褐指藻是一种海洋硅藻, 由Allen等于1910年分离得到[22], 其具有易于培养、可常年生长、生长速度快和易于调控的特点, 以三角褐指藻为研究对象具有很多优势。作者研究了温度和光照对三角褐指藻的生长及岩藻黄素含量的影响, 包括不同的温度条件、不同的光照强度和光质条件, 为三角褐指藻用于岩藻黄素的提取提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 藻种与培养

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)由本实验室提供。三角褐指藻采用f/2培养基[23], 在三角瓶中培养。温度条件为(20±2)℃, 光照强度为 4000 lx,光周期为12L∶12D。

1.2 实验方法

分别进行温度、光照强度和光质的影响实验, 每种条件做3个平行。以正常培养三角褐指藻作对照,分别设置不同的温度条件(20、25、30℃)、不同的光照强度(12800 lx、7200 lx、4000lx)和光质条件[红光(647～700 nm)、蓝光(470～475 nm)、绿光(491～574 nm)],进行实验。每天摇藻并更换三角瓶位置, 避免光照不均。

1.3 生长曲线的测定

从实验处理开始, 每日取藻液测定730 nm处的光密度。根据标准曲线回归公式y=107x+16315 (R2=0.9995)换算成细胞数, 其中, y为细胞密度(个/mL), x为光密度。

1.4 光系统II活性的测定

使用 IMAGING-PAM 调制脉冲荧光仪(Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany), 利用调制叶绿素荧光技术(Pulse-Amplitude-Modulation, PAM), 按照林阿鹏等[24]的测定方法进行样品叶绿素荧光参数的测量, 从而反映细胞的光合活性。对于不同实验条件处理的样品, 每个三角瓶各取藻液 200 µL, 分别加到96孔板的孔内, 然后使用IMAGING-PAM调制脉冲荧光仪(Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany),测量PSII实际光合效率Y(II)。每个样品在测定之前, 先暗适应 10 min。设定 PAR 为 36 µmol/(m2·s), 开始测定。

Y(II): PSII实际光合效率, 即PSII实际量子产量,由公式 Y(II)= (F′m-F)/F′m计算得到。

所有操作都在黑暗环境中进行。

1.5 岩藻黄素的提取[25]

采用离心法收集微藻细胞, 培养液在4000 r/min条件下离心5 min, 弃上清, 藻细胞沉淀用新鲜培养液洗涤 2次再离心, 收集的藻细胞用液氮速冻后保存在–80℃冰箱中。

按照5 mL/g的比例向收集的藻细胞中加入预冷(0～10℃)的甲醇与丙酮混合液作为提取液(甲醇∶丙酮=1∶1(V/V)), 充分震荡, 使藻细胞与提取液充分接触, 之后放在冰水浴中黑暗浸提5 min。以3000 r/min离心5 min, 收集上清, 分别用0.22 µm孔径的滤膜过滤, 然后直接进液相色谱系统分析。洗脱条件为:初始流动相为水(15%)∶甲醇(30%)∶乙腈(55%), 进行线性梯度至第15分钟; 然后转为流动相为水(0%)∶甲醇(15%)∶乙腈(85%)继续洗脱至第17分钟; 线性梯度转为流动相为甲醇(15%)∶乙腈(35%)∶乙酸乙酯(50%)继续洗脱至第30分钟, 再进行线性梯度转为流动相为甲醇(22%)∶乙腈(20%)∶乙酸乙酯(58%)洗脱直到洗脱结束。设置柱温为 50°C, 流速为0.75 mL/min。

1.6 数据处理

采用单因素方差分析(ANOVA)进行数据差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 温度对三角褐指藻生长及岩藻黄素含量的影响

不同温度对三角褐指藻生长的影响如图1所示。由图1可知, 与正常培养温度20℃相比, 25℃对三角褐指藻无明显影响(P>0.05), 而在 30℃条件下三角褐指藻的生长受到明显抑制(P<0.05)。

不同温度对三角褐指藻光合活性的影响如图 2所示。三角褐指藻在 25℃条件下的光合活性稍高于对照, 而 30℃条件下三角褐指藻的光合活性显著降低(P<0.05)。

不同温度对三角褐指藻岩藻黄素含量的影响如图3所示。从图中可看到在温度为25℃条件下, 三角褐指藻的岩藻黄素含量明显高于20℃的对照(P<0.05)。30℃条件下岩藻黄素含量则显著降低(P<0.05)。

图1 温度对三角褐指藻生长的影响Fig.1 Effect of different temperatures on the growth of P.tricornutum

图2 温度对三角褐指藻光合活性的影响Fig.2 Effect of different temperatures on the PSII activity of P. tricornutum

图3 温度对三角褐指藻岩藻黄素含量的影响Fig.3 Effect of different temperatures on the fucoxanthin content of P. tricornutum

2.2 光照强度对三角褐指藻生长及岩藻黄素含量的影响

不同光照强度对三角褐指藻生长的影响如图 4所示。由图4可知, 与正常培养光照强度为4000 lx相比, 12800 lx和7200 lx的光照强度明显促进三角褐指藻的生长(P<0.05), 而 7200 lx条件下三角褐指藻的细胞数高于12800 lx条件下的三角褐指藻。

图4 光照强度对三角褐指藻生长的影响Fig.4 Effect of different intensities of illumination on the growth of P. tricornutum

不同光照强度对三角褐指藻光合活性的影响如图5所示。与对照相比, 光照强度为12800 lx和7200 lx条件下, 三角褐指藻的光合活性均降低, 且12800 lx光照强度下光合活性降低更明显(P<0.05)。

不同光照强度对三角褐指藻岩藻黄素含量的影响如图6所示。与对照在4000 lx条件下相比, 12800 lx光照强度下, 三角褐指藻的岩藻黄素含量稍微提高,而7200 lx光照强度下岩藻黄素含量明显提高(P<0.05)。

图5 不同光照强度对三角褐指藻光合活性的影响Fig.5 Effect of different intensities of illumination on the PSII activity of P. tricornutum

图6 不同光照强度对三角褐指藻岩藻黄素含量的影响Fig.6 Effect of different intensities of illumination on the fucoxanthin content of P. tricornutum

2.3 光质对三角褐指藻生长及岩藻黄素含量的影响

不同光质对三角褐指藻生长的影响如图7所示。由图7可知, 三种光质, 红光条件下三角褐指藻生长良好, 而绿光和蓝光条件下则显著抑制三角褐指藻的生长(P<0.05)。

不同光质对三角褐指藻光合活性的影响如图 8所示。蓝光抑制三角褐指藻的光合活性, 处理1 h后,其Y(II)值即降为0。绿光对三角褐指藻的光合活性也有抑制作用, 处理6 h后Y(II)开始显著降低(P<0.05),到第48 小时降为0。红光较另外两种光而言, 并未抑制三角褐指藻的光合活性。

图7 不同光质对三角褐指藻生长的影响Fig.7 Effect of different light qualities on the growth of P.tricornutum

图8 不同光质对三角褐指藻光合活性的影响Fig.8 Effect of different light qualities on the PSII activity of P. tricornutum

不同光质对三角褐指藻岩藻黄素含量的影响如图9所示。与正常光的三角褐指藻相比, 蓝光条件下三角褐指藻的岩藻黄素含量显著降低(P<0.05), 绿光条件下处理1 d的三角褐指藻的岩藻黄素含量升高,而处理2 d和3 d后明显降低(P<0.05), 红光条件下处理 3 d后的三角褐指藻的岩藻黄素含量则显著升高(P<0.05)。

图9 不同光质对三角褐指藻岩藻黄素含量的影响Fig.9 Effect of different light qualities on the fucoxanthin content of P. tricornutum

3 讨论

岩藻黄素是一种重要的类胡萝卜素, 因其具有丰富的生理功能, 近年来受到广泛关注。Carreto和Catoggio研究发现[25], 三角褐指藻的岩藻黄素含量随着三角褐指藻的生长而逐渐降低。此外, Kosakowska等[26]的研究表明, 三角褐指藻在缺铁条件下岩藻黄素含量降低。

本研究考察了温度条件对三角褐指藻的生长及岩藻黄素含量的影响。结果表明, 25℃既适于三角褐指藻的生长, 又提高单位细胞内岩藻黄素的含量,这一现象表明, 由于三角褐指藻在 25℃时生长速度快, 因而捕获的光量子多, 又因为岩藻黄素在光系统的捕光复合物中起重要作用[2], 故岩藻黄素含量随捕获光量子的增加而增加。

另外, 光照强度(12800、7200和4000 lx)对三角褐指藻生长及岩藻黄素含量的影响实验结果表明,光照强度的升高促进了三角褐指藻的生长及岩藻黄素含量的升高, 可能由于光照强度的增大, 使得三角褐指藻可以捕获更多的光量子, 从而使岩藻黄素含量升高。

三种光质(红光、绿光、蓝光)对三角褐指藻的生长及岩藻黄素含量的影响实验结果表明, 绿光和蓝光处理3 d的三角褐指藻均死亡, 而红光处理的三角褐指藻生长状况良好。然而岩藻黄素的最大吸收峰在450 nm附近[27], 接近绿光和蓝光波长附近, 而红光波长为647～700 nm, 结果并不是三角褐指藻在绿光和蓝光下生长良好, 却是三角褐指藻在绿光和蓝光的波长范围内死亡, 在红光的波长范围内生长良好。这一现象产生的原因尚需进一步研究。

综上所述, 25℃、7200 lx和红光的培养条件是三角褐指藻生长和岩藻黄素积累的最适宜条件。

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