龙眼外果皮粗黄酮提取物对S180肉瘤的抑制作用研究

郭秋兰

（河南漯河医学高等专科学校药学系，漯河462002）

龙眼外果皮粗黄酮提取物对S180肉瘤的抑制作用研究

郭秋兰

（河南漯河医学高等专科学校药学系，漯河462002）

目的研究龙眼外果皮粗黄酮提取物对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用。方法以S180荷瘤小鼠为模型，观察龙眼外果皮粗黄酮提取物（100、200、300 mg·kg-1）组和龙眼外果皮粗黄酮提取物+CTX（20 mg·kg-1）组的抑瘤率，计算龙眼外果皮粗黄酮提取物+CTX组小鼠的胸腺指数、脾脏指数、巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，并采用ELISA法检测龙眼外果皮粗黄酮提取物组小鼠血清TNF-α的含量。结果不同剂量的龙眼外果皮粗黄酮提取物均可抑制S180肉瘤生长，抑瘤率分别为28.24%、44.91%、60.65%，且其对小鼠血清TNF-α含量影响不明显；CTX组抑瘤率为47.69%，龙眼外果皮粗黄酮提取物低、中、高剂量+CTX组抑瘤率分别为53.7%、65.74%、70.37%，龙眼外果皮粗黄酮提取物中、高剂量+CTX组与CTX组抑瘤率比较差异显著（P＜0.05），且龙眼外果皮粗黄酮提取物+CTX组，与CTX组比较，可不同程度地升高荷瘤小鼠的胸腺指数、脾指数、巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数（P＜0.05）。结论龙眼外果皮粗黄酮提取物可抑制S180肉瘤生长，具有抗肿瘤作用，且对化疗药物CTX具有增效减毒作用。

龙眼外果皮粗黄酮提取物；S180荷瘤小鼠；增效减毒；实验研究

无患子科龙眼的果实俗名桂圆，为我国著名的亚热带水果。传统中医学认为，龙眼肉安神、益心脾、补气血可用于治疗惊悸、怔忡、失眠、健忘、虚劳羸弱［1-3］，龙眼外果皮（龙眼壳）味甘、性温、无毒，其散邪祛风、聪耳明目，可治心虚头晕，研细治汤火伤亦佳，已确定龙眼外果皮中含有糖类、核苷类、萜类、香豆素、多酚等［4-6］，而目前对龙眼外果皮中总黄酮的提取研究鲜有报道。本研究从龙眼外果皮中提取了粗黄酮，测定了含量，并对其体内抗肿瘤作用方面进行了研究。

1 资料与方法

1.1 药品与试剂龙眼采自福建泉州，取外果皮洗净烘干粉碎；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、乙醇均为分析纯；环磷酰胺注射液（江苏恒瑞医药有限公司）；芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）。

1.2 仪器旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器公司）；101C-2B电热鼓风干燥箱（上海市实验仪器总厂）；AL104电子天平（上海有限公司）；恒温水浴锅（陕西太康生物科技有限公司）；高速万能粉碎机（黄骅卸甲综合电器厂），冷冻干燥仪（德国MARTIN CHRIST公司）。

1.3 动物及瘤株昆明种小鼠由河南省医学实验动物中心提供，体质量（26±3）g，均为雄鼠；S180肉瘤瘤株购自河南省医科所。

1.4 龙眼外果皮粗黄酮提取物的制备将龙眼外果皮洗净烘干后粉碎，过60目筛，称取约100 g，加8倍量95%乙醇，浸泡过夜，60℃加热回流提取，每次4 h，重复提取3次，合并3次提取液抽滤，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，即得龙眼外果皮粗黄酮提取物。

1.5 龙眼外果皮粗黄酮提取物定性鉴别［7］1）浓氨水反应：取提取物乙醇溶液1滴点在滤纸上，将滤纸放在氨水上方熏30 s，立即在紫外灯下观察。2）三氯化铝反应：取提取物乙醇溶液1滴点在滤纸上，滴加1滴质量浓度为1%的三氯化铝乙醇溶液，吹干，分别在可见光及紫外光下观察颜色变化。3）盐酸-镁粉反应：取提取物乙醇溶液1 mL于试管中，加入少许镁粉，再加入2滴浓盐酸，进行黄酮类化合物的显色反应。

1.6 龙眼外果皮提取物粗黄酮含量的测定采用聚酰胺吸附-硝酸铝显色法［8］，以芦丁标准品制作标准曲线，得线性回归方程A=1.8429 C-0.0004，C为质量浓度（mg· mL-1），A为510 nm吸光度值，线性范围为0～0.5 mg，相关系数R2为0.9999。

1.7 龙眼外果皮粗黄酮提取物对S180肉瘤生长抑制作用昆明种小鼠80只，按0.2 mL·只-1在小鼠右肢腋部皮下接种浓度为1×107个·mL-1的S180细胞悬液，制成实体瘤模型［9］。接种后随机分为8组，每组10只。模型组给生理盐水；CTX组仅第一天腹腔注射CTX 20 mg· kg-1；龙眼外果皮粗黄酮提取物低、中、高剂量组分别给提取物100、200、300 mg·kg-1，灌胃，1·d-1，连续14 d；CTX+龙眼外果皮粗黄酮提取物低、中、高剂量组第一天腹腔注射CTX 20 mg·kg-1然后分别给提取物100、200、300 mg·kg-1，灌胃，1·d-1，连续14 d。14 d后颈椎脱臼处死荷瘤小鼠，称体重，计算抑瘤率。抑瘤率（%）=（模型组瘤重-给药组瘤重）/模型组瘤重×100%。

1.8 龙眼外果皮粗黄酮提取物对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响观察荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响［10］，按上述方法观察14 d后，将模型组、CTX组、CTX+龙眼外果皮粗黄酮提取物组小鼠腹腔注射体积分数为20%的新鲜鸡红细胞1 mL，30 min后处死小鼠，腹腔注入生理盐水2 mL，用手挤压腹部两侧，使生理盐水与腹腔液充分混匀。吸出腹腔洗液1 mL，滴于载玻片上，移至37℃温箱中孵育30 min，然后用生理盐水漂洗，晾干。以甲醇、丙酮（体积比为1∶1）的混合液固定，40 mL·L-1Giensa-磷酸盐缓冲液染色3 min，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下数200个巨噬细胞，计算吞噬率和吞噬指数。吞噬百分率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞（200个），吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞数/计数的巨噬细胞数（200个）。处死动物取胸腺、脾脏称重，按照下列公式分别计算胸腺指数、脾脏指数：胸腺指数=胸腺重/体重，脾脏指数=脾脏重/体重［4］

1.9 ELISA法检测荷瘤鼠血清中TNF-α蛋白的表达按上述方法观察14 d后，将模型组、CTX组、龙眼外果皮粗黄酮提取物组小鼠眼眶采血，0.5～1.0 mL，收集血液，于4℃，3 000 r/min，离心10 min取上清。按照小鼠TNF-αELISA试剂盒使用说明书进行操作，测定荷瘤鼠血清中TNF-α蛋白含量。

1.10 统计学处理SPSS13.0统计分析软件分析，计量资料结果以（x±s）表示，行t检验及方差分析，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 龙眼外果皮粗黄酮提取物定性检验结果1）浓氨水反应：在紫外灯下观察，滤纸上呈现出极明显的灰褐色斑点，表明含有黄酮类化合物。2）三氧化铝反应：在可见光下滤纸上呈现出灰黄色斑点，在紫外光下滤纸上呈现出黄褐色荧光斑点，表明含有黄酮类化合物。3）盐酸-镁粉反应：在泡沫处呈紫红色，表明含有黄酮类化合物。

2.2 龙眼外果皮提取物粗黄酮含量经聚酰胺吸附-硝酸铝显色法测定龙眼外果皮提取物粗黄酮含量为61.98%。

2.3 龙眼外果皮粗黄酮提取物对S180肉瘤的生长抑制作用龙眼外果皮粗黄酮提取物各组均可抑制S180肉瘤的生长，其低、中、高剂量组抑瘤率分别为28.24%、44.91%、60.65%，并体现一定的量效关系，与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 龙眼外果皮粗黄酮提取物对S180肉瘤的抑制作用（x±s）

2.4 龙眼外果皮粗黄酮提取物提高CTX抑制S180肉瘤的作用表1显示，龙眼外果皮粗黄酮提取物能提高CTX抑瘤效果，龙眼外果皮粗黄酮提取物（高）+CTX组、龙眼外果皮粗黄酮提取物（中）+CTX组、龙眼外果皮粗黄酮提取物（低）+CTX组抑瘤率分别为53.7%、65.74%、70.37%，高于CTX组47.69%，其中龙眼外果皮粗黄酮提取物（高）+CTX组、龙眼外果皮粗黄酮提取物（中）+CTX组抑瘤率和CTX组比较差异显著（P＜0.05）。

2.5 龙眼外果皮粗黄酮提取物对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响荷瘤小鼠在注射CTX后胸腺指数、脾脏指数、巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数均降低，与模型组比较差异显著（P＜0.05），而合用了龙眼外果皮粗黄酮提取物后胸腺指数、脾脏指数、巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数均较CTX组增高，差异显著（P＜0.05），其见表2。

表2 龙眼外果皮粗黄酮提取物对荷瘤小鼠免疫功能的影响（x±s）

2.6 龙眼外果皮粗黄酮提取物对S180荷瘤小鼠血清TNF-α含量的影响与模型组比较，各组小鼠血清TNF-α水平差异无统计学意义，见表3。

表3 龙眼外果皮粗黄酮提取物对S180荷瘤小鼠血清中TNF-α含量的影响（x±s，n=10）

3 讨论

黄酮类化合物是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分，天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，黄酮类化合物具有抗氧化、抗衰老、抗辐射、抗肿瘤、抗炎镇痛、免疫调节、抑菌抗病毒、抗心脑血管疾病、降血糖、治疗骨质疏松等作用［11-15］。本实验从龙眼外果皮中提取了粗黄酮，以荷瘤小鼠为模型，对龙眼外果皮粗黄酮提取物进行了抗肿瘤作用体内实验研究，实验结果显示龙眼外果皮粗黄酮提取物低、中、高剂量组可明显抑制S180肿瘤细胞的生长，抑瘤率分别为28.24%、44.91%、60.65%；实验结果还显示龙眼外果皮粗黄酮提取和CTX合用，可提高CTX疗效，其中龙眼外果皮粗黄酮提取物高剂量+CTX组比单用CTX组的抑瘤率提高了22.68个百分点，并且龙眼外果皮粗黄酮提取物可增强小鼠机体免疫力，能够对抗化疗药物CTX所致的免疫器官萎缩，免疫力的下降等不良反应即降低CTX毒性。

TNF-α抗肿瘤机制包括在体外对恶性肿瘤具有直接溶解及抗增殖作用，在体内引起肿瘤坏死；对毛细血管内皮细胞有直接的细胞毒作用，可造成肿瘤组织的局部血流阻断而发生出血、坏死；能增强炎症部位单核巨嗜细胞系统活性，增强NK细胞的细胞毒作用［16］。本实验结果表明龙眼外果皮粗黄酮提取物对荷瘤小鼠血清TNF-α的含量影响不明显，说明龙眼外果皮粗黄酮提取物可能通过其他机制发挥抗肿瘤作用，其机制还有待于进一步研究。

由此可见龙眼外果皮粗黄酮提取物是一种具有显著的抗肿瘤作用和增效减毒作用的天然药物。但本实验仅对龙眼外果皮粗黄酮提取物抗肿瘤作用进行了初步研究，其具体抗肿瘤机制尚未明确，因此尚需要对龙眼外果皮粗黄酮提取物抗肿瘤作用机制进行深入的研究。

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Research on Inhibition of S180 Sarcoma by Flavonoids Crude Extract from Exocarp of Longan

GUOQiulan
（Department of Pharmacy，LuoheMedicalCollege，HenanProvince，Luohe462002，China）

Objective To investigate the antitumor effects of flavonoids crude extract from exocarp of Longan on S180-bearing mice. Methods S180-bearing mice were given coarse flavones extract from exocarp of Longan and the tumor inhibitory rates of mice were detected in coarse flavones extract（100，200，300 mg·kg-1）groups and coarse flavones extract combined with CTX（20 mg·kg-1）groups.The thymus index，spleen index，macrophage phagocytic rate and phagocytic index were calculated in coarse flavones extract combined with CTX proups.ELISA method was used to detect the levels of serum TNF-α in coarse flavones extract groups.Results Coarse flavones extract from exocarp of Longan in different dose inhibited the growth of S180 sarcoma in mice and the tumor inhibitory rates were 28.24%，44.91%and 60.65%，respectively.However，the levels of serum TNF-α of mice didn't change.The tumor inhibitory rates of coarse flavones extract combined with CTX were 53.7%，65.74%and 70.37%，which were higher than those of CTX administration alone（47.69%）.Compared with those in CTX group，the thymus index，spleen index，macrophage phagocytic rate and phagocytic index were significantly elevated in all coarse flavones extract combined with CTX groups（P＜0.05）.Conclusion The flavonoids crude extract from exocarp of Longan has anti-tumor effect and can inhibit the growth of S180 tumor and has synergistic attenuation effect of CTX.

flavonoids crude extract from exocarp of Longan；S180-bearing mice；synergistic attenuation effect；experimental research

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.16.070

1672-2779（2015）-16-0143-03

：张文娟本文校对：张文娟

2015-06-26）