蛋用黑羽鹌鹑微卫星多态性分析

庞有志 吴胜军 赵淑娟 白俊艳 张小辉 贠银现 祁艳霞（河南科技大学动物科技学院 471003）

蛋用黑羽鹌鹑微卫星多态性分析

庞有志 吴胜军 赵淑娟 白俊艳 张小辉 贠银现 祁艳霞（河南科技大学动物科技学院 471003）

对蛋用黑羽鹌鹑群体9个微卫星座位的遗传多态性进行分析，旨在为黑羽鹌鹑遗传资源的评价、保护和利用提供新的依据。结果表明，9个微卫星座位共检测出46个等位基因，平均每个座位检测到5.1111个。平均杂合度为0.6952，平均多态信息含量为0.6204，表明蛋用黑羽鹌鹑是遗传多样性较丰富的群体。其中有8个微卫星可以作为黑羽鹌鹑群体的有效遗传标记进行群体遗传多样性分析。χ2检验表明，9个微卫星座位的基因分布均极显著偏离Hardy-Weinberg平衡（P＜0.01）。

黑羽鹌鹑；微卫星；羽色突变；不完全隐性突变；遗传多样性；试验

蛋用黑羽鹌鹑是本课题组最新发现的一种羽色突变，它是来自蛋用中国黄羽鹌鹑与朝鲜鹌鹑配套系的杂种，经分离、纯化培育而来。杂交验证初步证实，该羽色突变是由常染色体发生不完全隐性突变的结果。控制黑羽性状的基因h位于常染色体上，相对于等位基因H为不完全隐性，该基因座与性染色体Z上的基因座B/b和Y/y具有一定的互作关系[1]。目前关于鹌鹑的微卫星多态性研究并不多，国内仅见王惠影等[2]、常国斌等[3]、Olowofeso等[4]对野生鹌鹑微卫星的研究以及孟庆美等[5]、吴胜军等[6]对朝鲜鹌鹑研究的相关报道。本研究利用9个具有丰富多态信息含量的微卫星DNA，对新培育的蛋用黑羽鹌鹑进行多态性检测，旨在探讨蛋用黑羽鹌鹑的遗传多态性，为我国鹌鹑的遗传资源的评价、保护和利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

试验鹌鹑来自河南科技大学试验牧场，随机抽取蛋用黑羽鹌鹑100只，公母各半。每只心脏采血2ml，血样采用ACD抗凝，血液：ACD为6:1。-20℃冰箱中保存备用。

1.1.2 引物的选择及合成

从Kayang等[7]建立的鹌鹑微卫星连锁图谱中筛选多态性比较高的基因座，确定了9对微卫星基因座作为本次研究的遗传标记。引物序列送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。微卫星座位相关资料见表1。

表1 试验选用9个微卫星基因座的相关资料

1.2 方法

1.2.1 PCR反应条件

PCR反应体系总体积为12.5μl，其中ddH2O8.65μl，10×Buffer1.25μl， Mg2+（25mmol/L） 0.75μl， DNA 模 板0.5μl，上、 下游引物各 0.5μl（10mmol/L）， dNTPs0.25μl， Taq 酶0.1μl。PCR扩增反应程序：95℃预变性3min；94℃变性45s，X℃退火 60s，72℃延伸 60s，30次循环；最后 72℃延伸12min，4℃保存。退火温度具体见表1。

表29 个微卫星的等位基因大小和频率

1.2.2 扩增产物的检测及聚丙烯酰胺凝胶电泳

扩增产物用1.0×TBE的电泳缓冲液配制成的1%琼脂糖凝胶进行检测PCR扩增产物的有无。取PCR扩增产物3μl和等体积的上样缓冲液混合点样，电泳，并以DNAmarker作对照，在紫外透射分析仪上观察是否有所需的条带，若特异性条带明亮而且杂带很少，便可转到8%非变性丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。120V电泳2h左右，硝酸银染色后用成像仪拍照保存并分析。根据标准pBR322DNA/MspⅠMarker，检测等位基因片段大小，确定全部个体在各微卫星座位的基因型。

1.2.3 统计分析

通过分子生物软件POPGENE（Version1.32）分析每个基因座的多态信息含量（PIC）、有效等位基因数（Ne）、杂合度（H）。对各基因座的基因型分布按照Hardy-Weinerg平衡定律进行χ2检验。

2 结果

2.1 微卫星座位聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果

9个微卫星座位在蛋用黑羽鹌鹑群体中都具有明显的多态性，其中微卫星座位GUJ0023和GUJ0028电泳图结果详见图1和图2。可以看出微卫星座位GUJ0023和GUJ0028具有丰富的多态性。

图1 微卫星座位GUJ0023的PCR产物电泳图

图2 微卫星座位GUJ0028的PCR产物电泳图

2.2 微卫星等位基因及其频率

由表2可见，9个微卫星座位在蛋用黑羽鹌鹑群体中共检测到46个等位基因，平均等位基因数为5.1111。其中GUJ0023、GUJ0029、GUJ0057、GUJ0077在蛋用黑羽鹌鹑群体中均检测到6个等位基因，基因片段分别为：219～244bp、147～175bp、 145～170bp、 260～285bp。 GUJ0028、 GUJ0097、GUJ0059在蛋用黑羽鹌鹑群体中均检测到5个等位基因，基因片段分别为： 160～185bp、 130～170bp、 230～246bp。GUJ083和GUJ0063在蛋用黑羽鹌鹑群体中分别检测到4和3个等位基因，基因片段分别为：130～155bp、242～246bp。

微卫星位点 GUJ0097、 GUJ0083、 GUJ0077、 GUJ0063、GUJ0059、GUJ0057、GUJ0029、GUJ0028和GUJ0023在黑羽鹌鹑群体中分别有17、9、15、3、11、12、19、14和16种基因型。除了GUJ0028有两种优势基因（160bp、180bp）外，其他微卫星位点均只有一种优势基因。GUJ0097、GUJ0083、 GUJ0077、 GUJ0063、 GUJ0059、 GUJ0057、GUJ0029、GUJ0023优势基因分别为：147bp、147bp、260bp、 244bp、 246bp、 162bp、 160bp、 240bp。 GUJ0097、GUJ0083、 GUJ0077、 GUJ0063、 GUJ0059、 GUJ0057、GUJ0029、GUJ0028、GUJ0023的优势基因型分别为：147/147、 155/147、 270/260、 244/244、 246/246、 162/162、 160/160、180/160、240/240。对 9个微卫星座位进行 Hardy-Weinberg平衡检验，各基因座位均极显著偏离遗传平衡（P＜0.01）。

2.3 微卫星座位的基因杂合度和多态信息含量

由表3可以看出，在黑羽鹌鹑群体中微卫星位点GUJ0077具有最高的多态信息含量为0.7392，GUJ0028具有最高的杂合度为0.7852，同时GUJ0028也具有最高的有效等位基因数为4.6555。9个微卫星在黑羽鹌鹑群体中平均多态信息含量、有效等位基因数、杂合度分别为0.6204、3.5338和0.6952。

表3 9个微卫星等位基因数、多态信息含量、有效等位基因数、杂合度

3 讨论

有效等位基因数是纯合度的倒数，反映了微卫星位点上所有等位基因之间的相互影响程度。有效等位基因数越接近所检测到的等位基因的绝对数，表明等位基因在群体中分布越均匀。本研究的9个微卫星位点GUJ0023、GUJ0028、GUJ0029、 GUJ0057、 GUJ0059、 GUJ0063、 GUJ0077、GUJ0083和GUJ0097在鹌鹑总群体中有效等位基因分别为3.8760、 4.6555、 3.7258、 3.0544、 3.2755、 1.8574、 4.4504、2.7255和4.1841，9个微卫星座位的等位基因在群体中分布不均匀。

多态信息含量（PIC）是衡量等位基因片段多态性的理想指标，当PIC＞0.5时，表明该基因座为高度多态基因座；0.25＜PIC＜0.5时表明该基因座为中度多态基因座，PIC＜0.25时表明该基因座为低度多态基因座[8]。本研究所选的9个微卫星座位，除了GUJ0063在黑羽鹌鹑群体中为中度多态性座位外，其余8个微卫星座位均为高度多态座位，表明这8个高度多态基因座位可以作为黑羽鹌鹑群体的有效遗传标记进行遗传多样性分析。

本研究在蛋用黑羽鹌鹑群体9个微卫星座位中共检测到46个等位基因，平均等位基因数为5.1111，最低为3个，最高为6个，表明这些微卫星座位具有较高的多态性。遗传杂合度表示在微卫星座位上杂合子个体占畜禽群体的比例，它反映微卫星座位在畜禽群体中的遗传变异程度，一般认为它是度量群体遗传变异的一个最适参数。平均杂合度的大小可以近似地反映出遗传变异程度的高低，杂合度越高，表明群体内遗传多样性就越高，遗传变异程度就越大，反之则群体内遗传变异程度就小。孟庆美等[5]研究了朝鲜鹌鹑群体12个微卫星的平均杂合度为0.7111，吴胜军等[6]研究了朝鲜鹌鹑群体9个微卫星平均杂合度为0.7096。Farrag等[9]利用8个微卫星标记在伊朗的4个日本鹌鹑品系中的平均杂合度为0.6090。Hossein等[10]研究表明日本鹌鹑Pharach品系12个微卫星的平均杂合度为0.3873。而本研究的9个微卫星位点在黑羽鹌鹑群体中平均杂合度为0.6952，可以看出，新选育的黑羽鹌鹑群体的遗传多样性略低于朝鲜鹌鹑，而高于日本鹌鹑。这为蛋用黑羽鹌鹑的种质资源评价提供了重要依据。

χ2检验结果表明，本研究测定的9个微卫星座位在黑羽鹌鹑群体中均极显著偏离遗传平衡（P＜0.01）。遗传平衡与否与检测样本含量有一定关系，样本不够大时，有些基因座就可能检测不到全部的等位基因。Baker[11]指出，在检测每个品种时应分析25个样本数，为了避免出现误差样本数应达到50个。就本研究而言，样本含量（100）已经达到抽样的要求，表明遗传不平衡不是样本的原因，很可能是黑羽鹌鹑群体受到过度人工选择或近亲繁殖等因素的影响，这与近年来对黑羽鹌鹑进行小群体保种可能有关。

[1]于美琴,庞有志,赵淑娟,等.蛋用鹌鹑黑羽突变基因的遗传机制及其与伴性羽色基因互作关系的研究 [A].中国动物遗传育种研究进展——第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集[C].陕西杨凌,2009:438.

[2]王惠影,常洪,徐伟,等.家鹑与野生日本鸣鹑群体微卫星标记DNA的遗传学分析[J].畜牧兽医学报,2004,35(04):367-371.

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[4]OlowofesoOlajide,戴国俊,王金玉,等.华东4个鹌鹑群体微卫星标记的遗传多样性检测[J].扬州大学学报(农业与生命科学版),2006,27(01):29-32.

[5]孟庆美,孙永强,李大全,等.朝鲜鹌鹑遗传多样性微卫星标记分析[J].福建畜牧兽医,2007,29(01):1-2.

[6]吴胜军,庞有志,赵淑娟,等.朝鲜鹌鹑微卫星多态性分析[J].河南农业科学,2010(10):112-115.

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[11]Baker J S.Global protocol for determining genetics distance among domestic livestock breeds[J].Appl Livest Prod,1994,21:501-502.

河南省重点科技攻关项目（082102130002）；河南科技大学校基金项目（2008ZY016）。

庞有志（1963.4-），男，河南省新蔡县人，博士，教授，硕士研究生导师，主要从事动物遗传育种研究。