10种常见水果果汁体外抗EV71病毒研究

张炳丽 康 真 梁 爽 李 然 宋晓琳 范荣军

哈尔滨市疾病预防控制中心，黑龙江哈尔滨 150056

10种常见水果果汁体外抗EV71病毒研究

张炳丽 康 真 梁 爽 李 然 宋晓琳 范荣军▲

哈尔滨市疾病预防控制中心，黑龙江哈尔滨 150056

目的 观察10种常见水果果汁对手足口EV71病毒所引起细胞病变（CPE）的抑制作用。 方法 采用MTT比色法，测定10种常见水果果汁对Hep Ⅱ细胞的细胞毒性，并在对细胞的最大无毒浓度（MNCC）范围内，采用体外细胞培养法研究10种常见水果果汁对手足口EV71病毒病毒的抑制作用。在此基础上计算出苹果汁和葡萄汁对EV71病毒的半数抑制浓度的IC50值。 结果 在10种常见水果果汁中筛选出苹果汁和葡萄汁两种具有抗手足口EV71病毒作用的果汁，其IC50值分别为果汁原液的1.652倍稀释液和9.965倍稀释液。 结论 苹果汁和葡萄汁具有进一步筛选抗EV71病毒有效成分的研究价值。

果汁；EV71；抗病毒；体外；筛选

手足口病（HFMD）发病者主要是5岁以下婴幼儿，是一种由小RNA病毒引起的肠道传染性疾病，严重威胁婴幼儿健康，已成为西太平洋地区的重大公共问题之一[1]。EV71型或柯萨奇病毒A16组病毒作为病原可引起少数患儿发生免疫、神经和（或）循环系统等功能能紊乱而导致临床重症或死亡而关注度较高[2]，近年来引起的HFMD暴发流行越来越频繁，EV71引起的重症HFMD患者比例及病死率均明显高于其他肠道病毒[3]。

古有“神农尝百草”之举、“药食同源”之说，表述了食物可达到预防、辅助治疗疾病的目的[4]。“药食同源”的历史源远流长，早在周代《周礼·天官》中记载了疾医主张“五味、五谷、五药养其病”；春秋战国时期《黄帝内经》记载，“谷肉果，食养尽之，无使过之，伤其正也”。随后，“食治”“食养”“寓医于食”等概念相继被人们提出强调了药食同源植物在保健、预防和辅助治疗疾病等方面的作用[5]。

因对儿童喂食药物存在一些困难，并且药物对儿童的许多毒副作用都不详，EV71型手足口病又以5岁以下儿童为主，因此我们希望筛出对EV71病毒有抑制作用的儿童较易接受的果汁，来实现对手足口EV71病毒的治疗或预防作用。

1　仪器与试剂

1.1仪器

核酸提取仪（德国 QIAGEN公司，QIAcube 型），荧光定量 PCR 仪（美国 ABI 公司，7500 型），榨汁机（中国九阳，JYZ-B550型），超纯水仪（美国Millipore公司，Milli-Q型），CO2培养箱（日本 SANYO 公司，MCO-15A 型），酶标仪（美国 BIO-RAD 公司，MODEL680 型），倒置显微镜（日本 Nikon 公司，TE2000-5 型） 。

1.2水果

各种水果均购自于哈尔滨市农贸市场。

2　细胞和病毒

2.1实验细胞株

Hep Ⅱ细胞：人喉癌上皮细胞（本实验室传代细胞）。

表1　10种果汁各稀释度4天时对Hep Ⅱ细胞的毒性情况

2.2实验病毒株

EV71病毒：选择本实验室2013年采集置-70℃保存的咽拭子，经本实验室增毒后经real-time PCR方法检测，PE和EV71均为阳性，CA16为阴性样本。

3　方法

3.1果汁的制备

加果汁当日将购买的新鲜水果用清水冲洗干净后晾干保存，用榨汁机进行榨汁，新鲜果汁用超纯水稀释，过0.2μm滤膜过滤除菌置于4℃备用，

3.2病毒增殖和病毒感染性的测定[6-8]

具体操作与参考文献[8]病毒增殖和病毒感染性的测定方法相同。

3.3果汁细胞毒性检测

将果汁用超纯水1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25稀释，接种于准备好的细胞上，每个稀释度设4孔，同时设不加果汁的正常细胞对照培养，每日观察细胞病变，连续4d 观察果汁毒性，细胞出现病变者判为果汁毒性，并根据公式计算果汁对Hep Ⅱ细胞的毒性。数据统计结果在计算机中经SPSS13.0统计软件处理，细胞病变达10%以上判定为有细胞毒性。

3.4果汁对EV71病毒的作用[8-9]

具体操作见参考文献[8]利巴韦林对EV71病毒的作用部分。加样量为每孔加100μL起始稀释倍数为最小无毒性稀释倍数的果汁，并对倍稀释，连续8个稀释度，每个稀释度设4孔。酶标仪上490nm处测定OD值[9]。并根据公式计算利巴韦林注射液对EV71病毒的抑制率。数据统计结果在计算机中经SPSS 13.0统计软件处理。

病毒抑制率=（试验组平均OD值-病毒对照组平均OD值）/（细胞对照组平均OD值-病毒对照组平均OD值）×100%。

4　结果

4.1EV71病毒感染性的测定

根据在倒置显微镜下连续观察细胞病变，Reed-Muench 法计算TCID50。TCID50= Antilog [CPE＞50%病毒稀释度+（＞50%的百分数-50%）/（＞50%的百分数-＜50%的百分数）×lg10]计算结果本次实验的所得到的EV71病毒液的TCID50为：2.43×10-6/0.1mL。

4.2果汁细胞毒性检测结果

各种果汁各稀释度对Hep Ⅱ细胞的毒性情况如表1所示。

表2　10种果汁抗EV71病毒活性结果

由表1我们可以看出，西瓜汁、柚子汁、桃汁、苹果汁和梨汁在1∶5最低稀释度时对Hep Ⅱ细胞均无毒性作用，因此，将1∶5稀释度作为这五种水果的起始稀释倍数；葡萄汁、桔子汁和水果番茄汁这三种果汁在1∶10稀释度时对Hep Ⅱ细胞无毒性作用，因此，将1∶10稀释度作为这三种水果的起始稀释倍数；而菠萝汁和猕猴桃汁在1∶15稀释度时对Hep Ⅱ细胞无毒性作用，这两种果汁的起始稀释倍数设定为1∶15。

4.3果汁抗EV71病毒活性筛选

CPE观察法和MTT分析法检测果汁抗EV71病毒的抑制效率见表2。从表2数据我们可以看出，苹果汁和葡萄汁对EV71病毒有抑制作用。根据表2相关数据绘制苹果汁和葡萄汁对EV71病毒的抑制作用曲线，根据曲线拟合出的公式计算果汁对EV71病毒的半数抑制浓度（IC50）。把果汁稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以果汁的稀释倍数为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50%抑制率时候的果汁稀释倍数，就是IC50。

图1　苹果汁对EV71病毒抑制曲线

图2　葡萄汁对EV71病毒抑制曲线

由图1和图2公式计算，苹果汁对EV71病毒的半数抑制浓度的IC50计算值为0.3304倍稀释，因苹果汁1倍稀释时实际为原液的1∶5稀释，因此苹果汁的IC50值实际为原液的1.652倍稀释；葡萄汁对EV71病毒的半数抑制浓度的IC50计算值为0.9965倍稀释，因葡萄汁1倍稀释时实际为原液的1∶10稀释，因此苹果汁的IC50值实际为原液的9.965倍稀释。

5　讨论

EV71所致HFMD全年均可发病，无地域性限制，以5～7月为高峰季节，平均3～5d，潜伏期2～10d。EV71已被公认为是继脊髓灰质炎病毒被消灭以后最重要的嗜神经性肠道病毒[10]。患者、隐性感染及健康带毒者均可成为传染源；可经呼吸道、消化道及直接接触等多途径传播，故常引起聚集甚至难以控制的流行[6]。EV71病毒感染已经成为我国重要的公共卫生问题[11-12]，因此，寻找对EV71具有治疗或预防作用的物质具有重要意义[13-14]。

苹果和葡萄均是物美价廉的普通水果，市场供应很丰富。苹果汁是一种廉价的改善身体健康的饮品，苹果汁可以预防心脏病[15]，喝苹果汁也可清洁肝、肾，减少肝脏或肾脏疾病。葡萄汁被科学家们誉为“植物奶”[16]。食品专家卡迈勒教授说，葡萄因含有许多对身体有益的物质而在医疗方面具有重要意义。因此，这两种物质用来预防EV71病毒感染是十分可行的。

苹果汁和葡萄汁抑制率曲线显示，果汁在低浓度（高稀释倍数）时抑制率受浓度影响较大，但在高浓度（低稀释倍数）时抑制率受浓度影响较小，相对平缓趋于一条直线。该曲线在实验的浓度范围内拟合成一条对数曲线，但在实际中该曲线的X轴取值具有一定的范围，抑制率不可能无限增大。因我们使用的榨汁机不能完全获得水果的全部果汁，因此果汁获得率和相应的质量换算无法进行，我们只能用稀释倍数来表示。

本研究遗憾的是我们没有分析出苹果汁与葡萄汁中抵抗EV71病毒的成分，我们怀疑是维生素C，但使用黑龙江省药品检验所提供的维生素C标准品开展实验，结果显示其没有抑制EV71病毒感染的功效。这需要我们在今后的工作中继续探索。

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A study on anti-EV71 virus in vitro of 10 kinds of common fruit juice

ZHANG Bingli KANG Zhen LIANG Shuang LI Ran SONG Xiaolin FAN Rongjun
Harbin Center for Disease Control and Prevention, Harbin 150056, China

Objective To observe the inhibitory effect of 10 kinds of common fruit juice on cytopathic effect (CPE) caused by hand, foot and mouth EV71 virus. Methods The cytotoxicity of 10 kinds of common juice to Hep Ⅱ was determined by MTT assay. The inhibitory effect of 10 kinds of common juice on hand, foot and mouth EV71 virus was studied by cell culture in vitro within the maximum non-toxic concentration of cells (MNCC). Then inhibitory concentration 50 (IC50) values of apple juice and grape juice for EV71 virus were calculated. Results Apple juice and grape juice with the function of anti-hand， foot and mouth EV71 virus were selected from 10 kinds of common juice. The IC50values were respectively 1.652 times dilution and 9.965 times dilution of the original fruit juice. Conclusion Apple juice and grape juice have a research value of further selecting effective components of anti-EV71 virus.

Fruit juice; EV71; Anti-virus; In vitro; Select

R285.5

A

2095-0616（2015）10-13-04

黑龙江省普通高等学校营养与食品卫生学重点实验室开放课题资助项目（YYKFKT1203）。

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（2015-02-27）