卵巢及子宫内膜来源的浆液性癌、子宫内膜样癌p16、p53表达研究

蔡 健，华 平，胡志敏，王世凤，王玺皓，余 波

(成都市妇女儿童中心医院病理科，成都610092)

众所周知，卵巢和子宫内膜都可以发生子宫内膜样癌和浆液性癌，按目前流行的卵巢、子宫内膜癌的二元论分类，认为高级别的浆液性癌的预后要明显差于子宫内膜样癌，因此，不管肿瘤发生在卵巢还是子宫体，鉴别二者显得非常重要［1-2］。大量的研究表明p53、p16的表达情况对于鉴别二者起到非常重要的作用。我们将通过回顾性研究一组病例来阐明和进一步印证p53、p16在这两种疾病中的表达特征和差别。

1 材料及方法

1．1 材料

66例发生在卵巢或子宫内膜的被诊断为高级别浆液性癌或子宫内膜样癌的标本均选自我院2012～2015年病理科的存档蜡块(在本研究中并不特别去区分肿瘤是发生在卵巢还是子宫内膜)，标本均经4%甲醛固定，石蜡包埋。所有病例诊断参照WHO第四版标准。患者年龄从42～71岁，平均年龄(56 ±2．5)岁。

1．2 方法

将选定的存档石蜡块重新制成2～4μm的切片，苏木素-伊红(HE)染色和免疫组化染色，光镜观察;免疫组化染色采用SP法，鼠抗人单克隆抗体p16，p53及SP试剂盒均购自广州太阳生物有限公司，抗体工作浓度1∶100，操作步骤严格按说明书进行，以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照，以已知p16、p53阳性的浆液性癌组织作为阳性对照。结果判定标准:p53阳性定位于细胞核，以细胞核出现清晰的棕黄色颗粒为阳性;p16阳性定位于细胞浆、细胞膜或细胞核，以出现清晰的棕黄色颗粒为阳性。“-或+-”为无或不足5%的阳性细胞;“+”为5%～29%的肿瘤细胞着色，被认为弱阳性;“++”为约30%～69%的肿瘤细胞着色，中强阳性;“+++”为70%以上的肿瘤细胞着色，强阳性;在判定过程中结合细胞着色的强度进行综合评判，比如超过70%的肿瘤细胞阳性，但着色为中等强度，给予++的评判。然后对免疫组化结果半定量数值化，数值化规则如下:-或+-记为0分，+记为1分，++记为2分，+++记为3分，根据数值化结果建立数值化表。

1．3 工作方式

采用双盲法，即在结果出来之前组织学诊断和免疫组化结果判定分别独立进行，二者判定过程不彼此影响。阅片人员由一位副主任医师，一位高年资主治医师及一位住院医师完成。

1.4 统计学方法

采用SPSS19．0软件，运用卡方检验和线性相关分析，P＜0．05认为有统计学意义。

2 结果

2．1 免疫组化结果

66例病例中30例诊断为高级别浆液性癌，其镜下特点为:癌组织分化较低，呈复杂的小乳头或成片实体结构，三级核，众多的核分裂、凋亡，p53免疫组化染色:13 例(43．3%)强阳性，10 例(33．3%)中强阳性，7例(23．4%)弱阳性，无阴性表达;p16免疫组化染色:8 例(26．6%)强阳性，9 例(30．0%)中等强度阳性，10例(33．4%)弱阳性，3例(10．0%)阴性;36例被诊断为子宫内膜样癌，其组织学特点是分化较好，呈腺样或绒毛腺样，无或很少实体片状结构，核异型性不大，核分裂及凋亡少见，免疫组化染色，仅1 例(2．8%)p53 呈强阳性，3 例(8．3%)中强阳性，32例(88．9%)为阴性或弱阳性，同时有2例(5．6%)p16呈中强阳性，其余的均为阴性或弱阳性(见图1～4，表1、2)。

图1 p16(+++)，卵巢浆液性癌示胞浆及胞核强着色(×200倍)

图2 p53(+++)，同上例，切片中同一区域，胞核强着色(×200倍)

图3 p16(+++)，宫内膜浆液性癌，胞浆及胞核强着色(×100倍)

图4 p53(++)，同上例，切片中同一区域胞核中等强度着色(×100倍)

表1 30例浆液性癌p53、p16免疫组化结果及其数值化结果

表2 36例子宫内膜样癌的p53、p16免疫组化结果及p53的数值化结果

2．2 p53、p16在浆液性癌和子宫内膜癌中的表达及相关性

根据数据资料，为使p53结果更加客观，规定免疫组化数值大于或等于2属于病理性表达，小于或等于1属于非病理性表达。理由:野生型p53经常和mdm2发生作用导致其半衰期极短［3-4］，不容易被检测到，而突变型的p53蛋白由于容易和其他分子结合从而屏蔽了与mdm2的相互作用［3］，导致其在核内浓度提高，容易被检测到。结合表1、2数值可得如表3所示p53在子宫内膜样癌及浆液性癌中的病理性表达和非病理性表达结果。

表3 p53在浆液性癌及子宫内膜样癌中的病理性表达和非病理性表达合计表(例)

计算的Pearson卡方值 =29．091，差异性显著(P＜0．001)，推断出浆液性癌中p53的病理性表达与子宫内膜样癌中p53的病理性表达差异非常显著(P ＜0．001)。

另一方面，根据表1的抽样数据，可以计算出在浆液性癌中p16、p53表达情况的Spearman相关系数 (Correlation coefficient)［5］:r(Xp16，Xp53)=0．36，呈弱正相关(显著水平 P=0．05)，具有一定的统计学意义;由此我们认为至少在统计学层面p16和p53就线性关系而言存在内在关联(P≤0．05)。

由此得出结论:1、高级别浆液性癌与p53的突变强相关，而子宫内膜样癌基本不存在p53的改变(P＜0．005)。2、在高级别浆液性癌中，统计分析发现p53的表达似乎与p16的表达存在某种内在联系，即二者在这类癌症中存在同时阳性的倾向(弱线性正相关，相关系数 r=0．33，显著水平 P≤0．05)。

3 讨论

在所有女性恶性肿瘤中，发生在子宫内膜和卵巢的子宫内膜样癌(endometrioid carcinoma)及高级别浆液性癌(HGSCs)占了很大的比例，近20年国内外众多学者从形态学、组织发生学、免疫组化及分子生物学等角度的广泛研究，使人类对这类肿瘤有了相对透彻的了解，直至形成现在广泛流行的子宫内膜及卵巢癌二元发病模型(dualistic model of carcinogenesis)，即将这类肿瘤分为Ⅰ型和Ⅱ型，本文中子宫内膜样癌和高级别浆液性癌分别代表Ⅰ型和Ⅱ型。

Ⅰ型特征性地发生ERBB2/PI3K/AKT(PKB)/mTOR/cyclinD1或ERBB2/KRAS/BRAF(MAPKKK)/MEK(MAPKK)/ERK(MAPK)信号通路异常［4］，分化相对较高，生物学行为较惰性，因此恶性程度较低;Ⅱ型，则特征性地发生p53突变，分化较低，生物学行为高度侵袭。由于生物学行为的显著不同，准确区分它们在临床上显得非常重要［6-8］。从形态学角度，子宫内膜样癌总显示一定程度的器官样分化，呈腺样或乳头状，很少呈实体片状，癌细胞总显示一定的分化程度，异型性不是很大;而高级别浆液性癌，癌细胞常常排列成实体片状，可见纤细的小乳头，细胞分化程度低，异型性大。这种形态学的差异，本质上是由癌细胞分化程度的高低决定的，前者为中高分化，后者为低分化或未分化，这也是二元论在癌细胞分化方面的体现;从免疫组织化学角度，p53的高表达与癌细胞的低分化相联系，低表达则与高分化相联系，这是二元论在p53方面的体现。本研究中p53在浆液性癌和子宫内膜样癌中表达的显著差异，佐证了这样的差别，并显示形态学分类和分子分类(根据p53的表达情况)具有高度的一致性。

另一方面，本研究显示了p16在HGSCs的表达特征。如前所述，由于p53蛋白的生化特点，其阳性提示TP53基因的突变。p16蛋白的异常表达反映P16基因怎样的状况呢?一般而言蛋白质的异常表达可以出现在基因缺失、基因扩增、染色体畸变、基因突变或者受别的异常生物分子(转录因子)的影响。在本研究免疫组化切片中我们经常观察到p53和p16表达的一致性，即它们倾向于在肿瘤的同一区域阳性(如图1、2)，即使是灶性区域阳性，很多情况下阳性细胞的空间分布也是一致的，从统计学角度考虑，这种现象可能并非偶然。这一事实使我们有理由认为高级别浆液性癌p16的异常表达与突变的p53有关，即p16的异常表达系基因异常转录导致，倾向于异常p53上调p16，即突变的p53蛋白可能通过磷酸化的pRB反馈性地上调p16INK4a/p14ARF(这两个抑癌基因共用2个相同的外显子，由于读码框移位，从而表达不同的蛋白质);本研究结果显示p53和p16之间的确存在一定程度的线性关系。在文献报道中，强调了在生理条件下p16基因的一个独特的转录产物ARF(alternate open reading frame，又名p14ARF等)，通过屏蔽泛素蛋白连接酶MDM2，稳定野生型p53蛋白，延长了其半衰期，从而发挥肿瘤抑制作用的一个方面，且在病理状态p16INK4a/p14ARF表达也常常被上调［9-10］。因此在HGSCs情形，我们认为p16INK4a/p14ARF可能由于突变的p53蛋白的存在而被上调，而p14ARF又阻止p53蛋白(可能包括突变型)降解，从而形成一个正反馈环路，强化突变p53的致瘤作用。这是基于免疫组化观察和统计学结果的关于p53和p16在肿瘤发生发展中的协同关系的一个猜测，事实是否如此尚有待进一步的研究。

综上所述，本研究进一步证实了p53的异常表达(TP53突变)在子宫内膜样癌和高级别浆液性癌中的差别，并描述了它们不同的病理临床特征，由此说明准确区分它们具有重要的临床意义;提示了p53的异常表达在诊断过程中的重要作用;另一方面，通过p16的表达特点，及与p53的统计学联系，提示p16与p53之间可能存在的内在关系。这些结果及可能关系加深了我们对该类肿瘤的理解，并促进我们继续去研究该肿瘤的发生发展问题，揭示疾病更多的本质，为解决临床问题提供可能存在的帮助。关于p53、p16与女性生殖道上皮低分化癌之间关系更详尽的分子机制，本资料中并未提示，核内详尽分子机制(如p53-p16的精确调控关系及临床应用等)更有待进一步深入研究，以揭示更本质的肿瘤信息，并运用于临床实践。

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