人乳头瘤病毒18型L1蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达

麻粉莲，张骞，郑丽舒

中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所，北京 100052

人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）是一种闭环双链DNA 病毒，16 和18 型HPV 与宫颈癌的发生密切相关。全球每年约27万人死于宫颈癌，其中80%死亡病例发生在发展中国家[1]。阻断HPV感染是预防宫颈癌的重要途径之一。目前，上市的HPV16/18型二价HPV疫苗和HPV6/11/16/18型四价HPV疫苗均在9～26岁女性中用于预防宫颈癌，但价格较贵，且只能预防2 种高危型HPV 型别[2]。因此，研发抗原谱广、价格便宜、使用方便的新型HPV 疫苗具有重要意义。由于HPV具有多样性、体外培养困难和潜在的致癌性等特征，HPV 疫苗研发难以采用减毒活疫苗或死疫苗技术，只能进行基因工程疫苗研发。L1 蛋白是HPV 疫苗研究的主要靶抗原。昆虫杆状病毒表达系统具有磷酸化、糖基化和蛋白切割加工修饰等功能，表达产物的生物学特性与天然产物相似，安全性较高，制备过程简单，适用于蛋白质工程研发[3]。我们利用杆状病毒表达系统表达L1蛋白，为进一步研究新型HPV疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

昆虫细胞Sf9和载体pFastBac1购自美国Invitrogen 公司；大肠杆菌DH5α和DH10Bac 由本科室保存；L1基因根据NCBI 提供的HPV18 野生型L1基因序列（NC_001357.1）人工合成，全长1629 bp。

PCR仪、限制性内切酶和转染试剂CellFectin购自美国Invitrogen公司；DNA凝胶回收试剂盒和PCR产物回收试剂盒购自TaKaRa 公司；蛋白质和DNA marker 购自北京博迈德科技发展有限公司；鼠抗L1单克隆抗体购自Fitzgerald 公司；昆虫细胞培养基Sf900ⅡSFM和Grace不完全培养基购自Gibco公司；HRP标记羊抗小鼠IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 HPV18 L1序列的优化及TA克隆

为提高杆状病毒系统目的蛋白表达量，本实验根据Sf9 细胞密码子使用偏性，参考GenBank 中HPV18L1基因组序列，在不改变氨基酸序列的前提下，将L1基因编码区序列进行优化，并在基因起始密码子区域添加Kozak 序列，在5'和3'端分别添加EcoRⅠ和XbaⅠ限制性酶切位点，送Invitrogen 公司合成。将L1序列连接至pMD18-T 载体，转化宿主菌，挑克隆进行PCR和测序，鉴定正确的重组克隆质粒命名为pMD18T-L1。

1.3 重组杆状病毒转移载体pFB1-L1的构建

将重组克隆质粒pMD18T-L1和pFastBac1分别用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切，回收L1基因片段和pFastBac1 载体片段，经T4DNA 连接酶于16℃连接2 h，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，提取质粒，经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定，送Invitrogen 公司测序。鉴定正确的重组杆状病毒转移载体命名为pFB1-L1。

1.4 重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-L1的构建

将转移载体pFB1-L1 转化含Bacimd 和Helper质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，经50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL庆大霉素、10 μg/mL四环素和蓝白斑筛选，挑取白色菌落并对其反复稀释筛选，挑取克隆，采用通用引物M13F（5'-CCCAGTCACGACGT TGTAAAACG-3'）、M13R（5'-AGCGGATAACAATT TCACACAGG-3'）进行PCR 鉴定（反应条件：93℃预变性3 min；95℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸5 min，共30个循环；72℃再延伸7 min），将PCR产物送Invitrogen公司测序，鉴定正确的重组杆状病毒穿梭质粒命名为rBacmid-L1。

1.5 重组杆状病毒rBacmid-L1的包装

按照Bac-to-Bac 说明书，使用CellfectinⅡ转染试剂将重组质粒rBacmid-L1 转染对数生长期的Sf9细胞，以仅含脂质体的等量转染试剂转染Sf9细胞作为阴性对照，显微镜下观察致细胞病变。转染7 d后收集上清，即为第一代重组杆状病毒，命名为rBac-L1-P1。将rBac-L1-P1 按MOI=0.1，细胞数为1×106传代，感染对数生长期的Sf9 细胞，4 d 后出现细胞病变时收集上清，即为rBac-L1-P2，按此方法获得rBac-L1-P3。

1.6 重组杆状病毒的鉴定

1.6.1 PCR 鉴定 用DNA 提取试剂盒提取感染rBacmid-L1 的Sf9 细胞的病毒基因组，以其为模板、M13F 和M13R 为引物，PCR 扩增L1基因，反应条件同1.4，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6.2 间接免疫荧光法鉴定 将重组杆状病毒rBacmid-L1 感染96 孔板中培养的Sf9 细胞，以仅含脂质体的等量转染试剂转染Sf9细胞作为阴性对照，3 d 后移去培养上清，加入80%丙酮室温固定细胞10 min；弃丙酮，加入HPV18 L1 抗体，置37℃孵育1 h；加入FITC 标记的羊抗小鼠IgG 抗体，置37℃孵育1 h；加入60%甘油溶液封板，荧光显微镜下观察。

1.6.3 Western 印迹鉴定 重组杆状病毒rBacmid-L1感染Sf9昆虫细胞3 d后，离心收集上清和细胞沉淀。将上清用超滤管进行浓缩，细胞沉淀用PBS 重悬，分别取20 μL样品，经12% SDS-PAGE分离，电转移至NC膜上，5%脱脂奶封闭过夜；加入小鼠抗L1单克隆抗体，37℃孵育1 h；加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG 抗体，37℃孵育0.5 h，加入TMB 显色5 min。

2 结果

2.1 HPV18 L1序列的优化及TA克隆

按照Sf9 细胞密码子嗜性优化L1基因序列，氨基酸序列未发生改变。将重组克隆质粒pMD18TL1进行PCR，经琼脂糖凝胶电泳分析，可见1629 bp的L1基因片段（图1）。测序结果显示重组质粒pMD18-T-L1的序列正确。

2.2 转移载体pFB1-L1的鉴定

转移载体pFB1-L1的双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见5238 bp 的载体片段和1629 bp 的L1基因片段，大小与预期相符（图2）。测序结果表明，所获得的基因序列与L1基因的序列同源性为100%。

2.3 重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-L1的鉴定

图1 重组克隆质粒pMD18T-L1的PCR鉴定

重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-L1 的PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见约3829 bp（1629+2300 bp）的基因片段，与预期相符（图3）。测序结果表明，所获得的基因序列与L1基因序列的同源性为100%，表明L1基因已整合到Bacmid质粒上。

2.4 重组杆状病毒的包装

穿梭质粒转染Sf9 细胞3 d 后，在显微镜下观察。与阴性对照细胞相比，细胞变圆、变亮，间距变大，细胞出现破碎、脱落；转染7 d后细胞大片脱落，有明显细胞病变（图略）。

2.5 重组杆状病毒的鉴定

2.5.1 PCR 鉴定 提取感染rBacmid-L1 的Sf9 细胞的病毒基因组，以其为模板行PCR 扩增，产物经1%琼脂糖凝胶分析，可见约3829 bp（1629+2300 bp）的片段，与预期相符（图4）。测序结果显示重组质粒rBacmid-L1的序列正确，表明重组杆状病毒基因组中整合了L1基因。

图2 EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切pFB1-L1

图3 重组穿梭质粒rBacmid-L1的PCR鉴定

图4 重组杆状病毒基因组中L1基因的PCR鉴定

2.5.2 间接免疫荧光法鉴定 间接免疫荧光结果显示，感染rBacmid-L1的Sf9细胞可见绿色荧光，而仅含脂质体的转染试剂转染的Sf9 细胞（阴性对照）无荧光（图5），表明重组杆状病毒的L1基因在Sf9昆虫细胞中获得表达。

2.5.3 Western 印迹鉴定 Western 印迹结果显示，rBacmid-L1感染的Sf9细胞的上清中无特异性条带，而细胞沉淀可与鼠抗L1 单克隆抗体发生特异性反应，在相对分子质量约60 000 处可见特异性条带，大小与L1蛋白相符，仅含脂质体的转染试剂转染的Sf9 细胞无特异性条带产生（图6）。表明L1基因已在rBacmid-L1感染的Sf9细胞中得到表达。

3 讨论

昆虫杆状病毒表达系统（baculovirus expression vector system，BEVS）是继大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统后建立的另一个高效表达系统。BEVS主要由转移载体、杆状病毒载体和昆虫细胞系三个部分组成。构建重组杆状病毒时，先将外源基因克隆至转移载体，构建成重组转移载体；然后重组转移载体和杆状病毒骨架共转染宿主细胞，将外源片段插入病毒基因组中；再通过特定的筛选标记和方法获得重组病毒，在昆虫细胞内复制，外源基因得以表达[4]。本研究中，我们将L1基因克隆至pFastBac1质粒中，重组质粒转化携带杆状病毒基因组的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac，筛选转座后的阳性重组杆状病毒rBacmid-L1，转染Sf9细胞后获得携带L1基因的重组杆状病毒颗粒，经扩增后感染昆虫细胞，收获L1蛋白。结果表明，HPV18 L1蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中获得成功表达。

图6 Western印迹检测L1蛋白的表达

HPV L1蛋白占病毒外壳主要组成的90%左右，是病毒诱导机体产生特异性中和抗体的主要刺激物，体外表达的L1 蛋白具有组装成病毒样颗粒（VLP）的能力[5]。目前上市的HPV疫苗均以L1蛋白为靶抗原。HPV16/18 型二价HPV 疫苗的L1 VLP通过啤酒酵母细胞产生，酵母表达系统表达外源蛋白水平高，但其糖基化修饰具有局限性。HPV L1蛋白亦可在大肠杆菌中表达，但其缺乏蛋白翻译后的糖基化等修饰加工过程，多数形成包涵体。HPV6/11/16/18 型四价HPV 疫苗的L1 VLP 利用昆虫细胞产生，昆虫细胞不仅培养条件与大肠杆菌及酵母细胞接近，而且细胞易破碎，表达外源蛋白的水平较高，可以进行蛋白翻译后的加工修饰。酵母细胞表达的L1 VLP 大小不一，而昆虫细胞表达的Ll VLP 颗粒相对均一，活性较好[6-7]。不同于HPV 二价疫苗使用的粉纹夜蛾Hi-5 昆虫细胞，本研究采用Sf9昆虫细胞，密码子优化后的HPV18L1基因在Sf9昆虫细胞实现了高水平表达。本研究中，我们以感染rBacmid-L1的Sf9细胞的病毒基因组为模板进行PCR鉴定，证明获得了重组杆状病毒rBacmid-L1；将感染rBacmid-L1 的Sf9 细胞行免疫荧光检测，可见特异性绿色荧光；Western 印迹鉴定在60 000 处可见特异性条带，并且仅在细胞沉淀中检测到L1 蛋白。因此，利用杆状病毒表达系统，我们成功表达了HPV18 L1 蛋白，对新型HPV 疫苗的研发具有现实意义。

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[3]李卫国,王厚伟,牟志美,等.昆虫重组杆状病毒获得技术研究展望[J].山东农业大学学报,2003,34(1):134-138.

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