中华鳖肠道益生菌的筛选、鉴定与生长特性研究

张 棋 吴志新 李 景 胡 明 石 焱 任雨薇 陈孝煊



中华鳖肠道益生菌的筛选、鉴定与生长特性研究

张 棋 吴志新 李 景 胡 明 石 焱 任雨薇 陈孝煊

(华中农业大学水产学院, 农业部淡水生物繁育重点实验室, 淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心, 武汉 430070)

通过点种法初筛和牛津杯法复筛, 从中华鳖肠道筛选到1株对嗜水气单胞菌()、温和气单胞菌()以及豚鼠气单胞菌()具有拮抗作用的益生菌株Dec-43。对该菌株进行形态、生理生化特征分析, 结果与《常见细菌系统鉴定手册》中屎肠球菌()的生理生化特征一致。提取细菌基因组DNA, 通过16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增, 从该菌株的16S rRNA基因中克隆到了一个长度1448 bp的片段, 经测序和序列比对, 该片段与Genbank中屎肠球菌的序列相似性达99%, 因此, 该菌株确定为屎肠球菌。通过单因素试验确定了该菌株的最佳生长温度、盐度、初始pH、接种量等参数分别为: 36℃、盐度0.6%、培养基初始pH 7、接种量10%; 通过正交试验, 确定了该菌株培养基中碳源(葡萄糖)、氮源(蛋白胨)最适含量分别为15和10 g/L。研究发现了一株中华鳖肠道潜在益生菌, 并研究了其生长特性, 为中华鳖养殖行业益生菌的应用提供了基础。

中华鳖肠道; 益生菌; 拮抗作用; 屎肠球菌; 生长特性

中华鳖()是我国重要的水产养殖品种, 在我国水产养殖行业占据着重要地位。但是, 在中华鳖的养殖过程中, 嗜水气单胞菌()、温和气单胞菌()以及豚鼠气单胞菌()等病原菌可引起多种疾病[1—4], 造成巨大的经济损失。目前, 对于中华鳖细菌性疾病防治主要依赖抗生素等药物, 但随着抗生素的大量使用, 也带来了越来越多的问题: 如病原菌的抗药性、养殖水体的菌群失调, 以及药物残留问题[5]。益生菌能有效提高宿主生长性能、消化能力[6], 增加宿主特定生长率, 抑制病原细菌的生长, 提高饲料利用率[7]。益生菌通过促进宿主血清溶菌酶活性、补体旁路活性以及头肾吞噬细胞的吞噬活性和呼吸暴发活性, 能显著提高宿主免疫力, 使得宿主对病原菌的抗病能力显著提高[8]。同时益生菌也能有效降低水体硝酸盐、亚硝酸盐、氨氮含量, 净化水质, 改善水产养殖动物生存环境[9]。目前报道的中华鳖益生菌主要为芽孢杆菌, 如枯草芽孢杆菌[6]。本项研究从中华鳖肠道菌群中分离到一株对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌具有拮抗作用的益生菌, 并对其生长特性和培养条件等进行研究, 为中华鳖益生菌的研究与开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康的中华鳖,购自江西金龟王实业有限责任公司, 用于筛选益生菌。

实验菌株嗜水气单胞菌CCAM050021菌株、温和气单胞菌CCAM050055菌株, 由本实验室保存; 豚鼠气单胞菌由福建省农科院提供。

培养基肉汤培养基(牛肉膏蛋白胨培养基): 牛肉膏 5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂 2%, pH 7.2—7.4。

实验试剂细菌基因组DNA提取试剂盒(康为世纪), 2×PCR Master Mix(Sinobio), 胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit, Biomiga)。

1.2 实验方法

中华鳖肠道细菌的分离在无菌条件下, 解剖健康中华鳖, 取出肠道, 刮取中华鳖的肠道内容物0.2 g, 分别按1∶10 (/) 的比例加入灭菌生理盐水稀释, 样品设为10–1, 再用灭菌生理盐水对10–1样品进行10倍稀释至10–7, 各稀释度样品均置于涡旋振荡仪上振荡均匀。取10–3、10–4和10–53个稀释度各0.1 mL涂布于牛肉膏蛋白胨平板, 每个稀释度涂布3个平板, 28℃恒温培养24—28h。然后选取菌落清晰、分散且菌落数在30—300个之间的平板, 随机挑取30—50个菌落, 编号, 作为待测菌株。将纯化后的待测菌株接种到牛肉膏蛋白胨斜面培养基上, 28℃培养24—28h后置4℃冰箱中备用。

益生菌的初筛采用点种法进行初筛, 调整指示菌(嗜水气单胞菌、温和气单胞菌以及豚鼠气单胞菌)菌液浓度为106cfu/mL, 吸取0.1 mL涂布于牛肉膏蛋白胨平板上。然后挑取一环筛选的菌株点种于平板上。28℃培养24h, 观察抑菌圈。

益生菌的复筛采用牛津杯法进行复筛, 选取初筛中抑菌效果明显的细菌, 活化24h后调整浓度为106cfu/mL。将指示菌菌液浓度调整为106cfu/mL, 吸取0.1 mL涂布于牛肉膏蛋白胨平板上。用无菌镊子取灭菌后的牛津杯置于涂有指示菌的平板上, 轻压, 使杯底紧贴于培养基上。每个牛津杯加入0.2 mL初筛的益生菌菌液。然后将平皿放入28℃的恒温箱培养24h, 测抑菌圈大小。

益生菌的酸耐受实验将益生菌活化后, 调整菌浓度为1×108cfu/mL, 按5%的接种量分别接种到pH为2.0、3.0、4.0、5.0的牛肉膏蛋白胨培养基, 36℃、200 r/min震荡培养, 1h、2h后取菌液进行涂平板计数, 计算存活率。

益生菌的生理生化鉴定以及16S rRNA基因序列分析 参照《常见细菌系统鉴定手册》[10], 依据形态及生理生化特征对分离的益生菌进行鉴定。利用试剂盒提取益生菌的DNA, 用引物27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′, 1492R: 5′-TAC GGYTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增, PCR反应体系组成: 2×PCR Master Mix 12.5 μL, 引物27F和1492R各1 μL, 模板DNA 1 μL, 最后用灭菌双蒸水补充至25 μL。反应程序为: 95℃ 3min; 90℃ 30s, 55℃ 1min, 72℃ 1.5min, 共30个循环; 最后72℃ 10min, 4℃结束反应。PCR扩增产物经1% (/)琼脂糖凝胶电泳, 产物经切胶回收后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。序列在Genbank上进行Blast比对, 选择与比对序列相似度高的菌株。

拟选菌株生长曲线的测定将益生菌菌株按5%的接种量接种到牛肉膏蛋白胨培养基中, 36℃转速200 r/min震荡培养, 每2h测定培养基在600 nm的OD值(Optical Density), 以未接种的培养基作为对照。确定细菌进入稳定期所需时间, 实验重复3次。

益生菌培养条件的优化按5%的接种量, 将益生菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中, 分别放在16℃、20℃、24℃、28℃、32℃、36℃、40℃、44℃恒温摇床中培养, 转速为200 r/min, 在600 nm处测OD值, 确定最适生长温度。在最适生长温度下, 分别按2%、4%、6%、8%、10%、12%的接种量接种到牛肉膏蛋白胨培养基, 测定最佳接种量; 设置牛肉膏蛋白胨培养基初始pH (分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、不同盐度(分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%), 按5%的接种量, 最适温度下200 r/min震荡培养, 600 nm处测OD值。以上实验均重复3次。

不同碳氮比对益生菌生长的影响以培养基蛋白胨浓度分别为5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%, 葡萄糖浓度分别为5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%设计正交试验, 培养条件为前述确定的最佳培养条件, 转速200 r/min震荡培养。

2 结果

2.1 益生菌的初筛

本实验从肠道中分离纯化出400株菌株, 初筛发现5株对三种病原菌均具有拮抗的菌株, 菌株编号分别为Oct-44、Oct-72、Dec-31、Dec-43、Dec-62。

2.2 益生菌的复筛

上述5株细菌对三株病原菌的抑菌圈见表1, 表明菌株Dec-43对三株病原菌均具有较好的拮抗作用。

2.3 益生菌的酸耐受实验

菌株Dec-43在不同pH耐受实验的存活率如表2。菌株Dec-43对低pH耐受性较强, 在pH为2时,处理1h后, 存活率为68.4%, 处理2h后, 存活率为50.2%, 在pH为3—5时, 1h后的存活率为97%以上, 2h后的存活率也达到88%以上。

2.4 菌株生理生化结果分析以及16S rRNA基因序列分析结果

菌株Dec-43生理生化特性见表3。所测项目与《常见细菌系统鉴定手册》[10]中屎肠球菌()的描述一致。测序得到Dec-43 16S rRNA基因序列长度为1448 bp, 在GenBank数据库进行Blast比对, 结果显示Dec-43与屎肠球菌的序列相似性达99%。根据Dec-43及与其相似的细菌序列, 利用ClustalX 1.83和Mega 5.10软件构建系统发育树, 结果显示Dec-43与屎肠球菌的亲缘关系最近(图1)。根据菌株Dec-43的生理生化特性与16S rRNA分子鉴定结果, 确认该菌株为屎肠球菌。

2.5 Dec-43的生长曲线

由图2可知, 当培养时间达到16h之后, 菌液OD值变动的幅度不大, 说明细菌生长缓慢, 已进入稳定期, 选择24h作为后期实验测定菌液600的时间点。

2.6 不同培养条件对Dec-43生长的影响

由图3可知, 随着培养温度的升高, 培养基中细菌数量逐渐增多, 当温度在36℃时, 培养24h后菌液OD值最大。随着接种量的增加, 培养基中细菌数量逐渐增多, 但接种量达到一定量后, 反而会不利细菌的生长, 当接种量为10%时, 培养24h后菌液OD值最大。随着培养盐度的升高, 培养基中细菌数量逐渐增多, 但盐度达到一定浓度后, 反而会不利细菌的生长, 当盐度为0.6%时, 培养24h后菌液OD值最大。由图可知, Dec-43在培养基pH较低和较高的情况下均具有一定的生长能力。当初始pH为7时, 培养24h后菌液OD值最大。

表1 分离株对指示菌株的拮抗作用

注: 表中的数字为抑菌圈的直径, 单位为“cm”; “－”表示没有抑制作用

Note: The data in the table was processed diameter of inhibition zone. The unit “cm” and “－” means there was no inhibiting effect

表2 不同pH条件和处理时间下Dec-43的存活率

注: 数据以平均值±标准差表示

Note: Data are presented as mean±standard deviations

表3 菌株Dec-43的生理生化特征

注: +为阳性, –为阴性

Note: + means positive, – means negative

2.7 不同碳氮比对Dec-43生长的影响

正交试验结果如表4所示, 结果表明, 葡萄糖含量为15 g/L, 蛋白胨含量为10 g/L是最佳的碳氮比。在最佳培养条件下, 该菌在培养24h后菌液中菌浓度可达到3.6×109cfu/mL。

表4 碳氮比对菌株Dec-43生长影响的正交实验

3 讨论

动物肠道具有特定的微生态环境, 肠道内固有菌群对宿主肠道微生态环境具有较强适应性, 因此选定肠道内固有菌群作为益生菌筛选的来源有利于益生菌的定植[11], 许多益生菌的筛选都是从肠道菌群中进行筛选的[12, 13]。益生菌筛选的一种比较普遍的方法是体外拮抗实验, 选出能够在固体培养基中对指示菌株生长具有抑制现象的益生菌菌株[14]。本实验通过点种法初筛和牛津杯法复筛得出的菌株Dec-43对指示菌株均具有良好的体外拮抗作用, 具有益生菌潜在作用。

研究表明, 中华鳖胃液中蛋白酶最适pH为2.2, 该酶在胃内也可能处于最适pH状态[15], 说明中华鳖胃液pH偏酸性。而益生菌需要通过消化道进入机体定植后才能发挥作用, Satish Kumar等[16]从鲻肠道内筛选出了一株屎肠球菌, 该菌株能在pH为2.0的肠液处理2h后仍然具有一定的存活率, 说明该菌株耐酸能力强。本实验筛选出的菌株能够耐受较高的酸性条件, 在pH为2时, 处理2h后, 存活率仍然有50%左右, 这对于菌株Dec-43顺利通过胃到达肠道提供了条件。

屎肠球菌是目前应用比较广泛的一种肠道益生菌, 1984年美国食品药品管理局(FDA)及美国饲料监察协会(AAFCO)已经允许屎肠球菌和粪肠球菌作为饲料安全菌种使用, 我国《饲料添加剂品种目录(2008)》允许使用的饲料级微生物菌种也包括屎肠球菌。屎肠球菌可作为多种动物的益生菌, 宿主包括猪[17]、鼠[18]、鸡[19]、牛[20]、欧洲鳗鲡[21]等。有研究表明, 通过投喂屎肠球菌, 仔猪生长性能、免疫和抗氧化功能都有了相应的提高[22]; 通过对小牛投喂该菌, 发现该菌亦对宿主免疫功能有调节作用[23]; 通过实验证实屎肠球菌能有效增强鲤抵抗嗜水气单胞菌感染[24]。但是目前用于中华鳖肠道益生菌的屎肠球菌还没有报道。本实验从健康中华鳖肠道内筛选出对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和豚鼠气单胞菌具有拮抗作用的益生菌株Dec-43, 并通过生理生化反应以及16S rRNA基因序列分析鉴定确认为屎肠球菌, 具有潜在的应用前景。此外, 本实验还确定了菌株Dec-43最佳生长温度、盐度、初始pH、接种量以及培养基中碳源(葡萄糖)、氮源(蛋白胨)最适含量等技术参数, 为该菌株应用于生产实践提供了一定的理论依据。

[1] Luo F X, Mao P, Wang R H,Studies on pathogenic identification and drug sensitivity analysis of skin fester disease in[J]., 2013, 34(3): 85—89 [罗方兴, 毛盼, 王荣华, 等.中华鳖腐皮病的病原鉴定与药敏试验. 水生态学杂志, 2013, 34(3): 85—89]

[2] Zeng D, Zhong L, Luo F X,Isolation and identification of pathogenic bacteria from complication of“skin-rotting” disease and furunculosis disease and drug sensitivity analysis [J]., 2013, 36(4): 74—78 [曾丹, 钟蕾, 罗方兴, 等.中华鳖“腐皮、疖疮”并发症致病菌的病原分离与药敏试验分析. 湖南师范大学自然科学学报, 2013, 36(4): 74—78]

[3] Ma Y Z, Shu M A. Studies on the pathogens of disease ofin[J].(Science Edition), 2000, 27(3): 329—333 [马有智, 舒妙安. 中华鳖温和气单胞菌病的病原研究. 浙江大学学报, 2000, 27(3): 329—333]

[4] Wu H X, Xue J Z. Pathogens of haemorrhagic intestinal necrosis in soft-shelled turtle () and their drug sensitivity [J]., 2004, 24(4): 343—345 [吴惠仙, 薛俊增. 中华鳖出血性肠道坏死症病原及其药敏性. 中国兽医学报, 2004, 24(4): 343—345]

[5] Li H B, Song X L, Li Y,. Progress on probiotic bacteria in aquiculture [J]., 2008, 29(5): 94—99 [李海兵, 宋晓玲, 李赟, 等. 水产动物益生菌研究进展. 动物与医学进展, 2008, 29(5): 94—99]

[6] Guan Y Q, Zhou H, Zhang L,. Effect ofon growth performance, digestive enzyme activities and blood biochemical indices of[J]., 2010, 22(1): 235—240 [管越强, 周环, 张磊, 等. 枯草芽孢杆菌对中华鳖生长性能、消化酶活性和血液生化指标的影响. 动物营养学报, 2010, 22(1): 235—240]

[7] Wu Z X, Feng X, Xie L L,.Effect of probioticCh9 for grass carp,(Valenciennes, 1844), on growth performance, digestive enzyme activities and intestinal microflora [J]., 2012, 28(5): 721—727

[8] Geng X, Dong X H, Tan B P,Effects of dietary probiotic on the growth performance, non-specific immunity and disease resistance of cobia,[J]., 2012, 18(1): 46—55

[9] Liu Y, Shu Q Y, Lou C Y,. Selection and identification of two photosynthetic bacteria strains and their purification effect for aquaculture wastewater [J]., 2013, 43(5): 57—61 [刘洋, 舒巧玉, 楼春燕, 等. 两株光合细菌的分离鉴定及其水质净化效果研究. 淡水渔业, 2013, 43(5): 57—61]

[10] Dong X Z, Cai M Y. Manual of Systematic and Determinative Bacteriology [M]. Beijing: Science Press. 2001, 256—258 [东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册. 北京: 科学出版社. 2001, 256—258]

[11] Jiang Q H, Ye Y W, Hu W,. Selection and characteristic analysis of potential probiotic strains againstfrom the intestine of[J]., 2012, 42(2): 22—39 [蒋启欢, 叶应旺, 胡王, 等. 银鲫肠道内抑制嗜水气单胞菌的潜在益生菌筛选及其特性研究. 淡水渔业, 2012, 42(2): 22—39]

[12] Zhou J M, Wu Z X, Zeng L B,. Selection and characterization of pathogen antagonized probiotics from intestinal tract of yellow catfish () [J]., 2012, 36(1): 78—84 [周金敏, 吴志新, 曾令兵, 等. 黄颡鱼肠道病原拮抗性芽孢杆菌的筛选与特性研究. 水生生物学报, 2012, 36(1): 78—84]

[13] Fan R F, Wang Y G, Liang Y,. Screening and identification of a eurythermal probiotic bacterium in the intestine of cultured[J]., 2011, 32(1): 40—46 [樊瑞锋, 王印庚, 梁友, 等. 一株广温性大菱鲆肠道益生菌的筛选与鉴定. 渔业科学进展, 2011, 32(1): 40—46]

[14] Feng F, Jiang Q H, Zeng K,. Progress research on mechanism of action and selection methods in probiotics [J]., 2011, 22: 52—58 [冯凡, 蒋启欢, 曾凯, 等. 益生菌作用机制及筛选方法研究进展. 现代农业科技, 2011, 22: 52—58]

[15] Long L Q, Bai D Q, Liang Y J,. Distribution of three major digestive enzymes of digestive tissue of[J]., 1997, 32(6): 23—26 [龙良启, 白东清, 梁拥军, 等. 幼鳖胃肠胰组织中主要消化酶活性分布. 动物学杂志, 1997, 32(6): 23—26]

[16] Satish Kumar R, Kanmani P, Yuvaraj N,. Purification and characterization of enterocin MC13 produced by a potential aquaculture probiontMC13 isolated from the gut of[J]., 2011, 57(12): 993—1001

[17] Wang Z, Burwinkel M, Chai W,. DietaryNCIMB 10415 and zinc oxide stimulate immune reactions to trivalent influenza vaccination in pigs but do not affect virological response upon challenge infection [J]., 2014, 9(1): e87007

[18] Sun P, Wang J Q, Jiang Y M. Effects of(SF68) on immune function in mice [J]., 2010, 123: 63—68

[19] Capcarova M, Hascik P, Kolesarova A. The effect of selected microbial strains on internal milieu of broiler chickens after peroral administration [J]., 2011, 91(1): 132—137

[20] Peng H Y, Tiantong A, Chen S E,. UltrasonicatedSF68 enhances neutrophil free radical production and udder innate immunity of drying-off dairy cows [J]., 2013, 80(3): 349—359

[21] Chang C I, Liu W Y. An evaluation of two probiotic bacterial strains,SF68 and, for reducing edwardsiellosis in cultured European eel,L [J]., 2002, 25(5): 311—315

[22] Wen J, Sun J A, Zhou X X,. Effect ofon growth performance, immune and antioxidant function of piglets [J]., 2011, 23(1): 70—73 [文静, 孙建安, 周绪霞, 等. 屎肠球菌对仔猪生长性能、免疫和抗氧化功能的影响. 浙江农业学报, 2011, 23(1): 70—73]

[23] Fleige S, Preißinger W, Meyer H H D,. The immunomodulatory effect of lactulose onfed preruminant calves [J]., 2009, 87(5): 1731—1738

[24] Gopalakannan A, Arul V. Inhibitory activity of probioticMC13 againstconfers protection against hemorrhagic septicemia in common carp[J]., 2011, 19(5): 973—985

THE SELECTION, IDENTIFICATION, AND CHARACTERIZATION OF THE GROWTH OF PROBIOTICS FROM INTESTINAL TRACT OF CHINESE SOFTSHELL TURTLE ()

ZHANG Qi, WU Zhi-xin, LI Jing, HU Ming, SHI Yan, REN Yu-wei and CHEN Xiao-xuan

(College of Fisheries, Huazhong Agricultural University/Key Lab of Freshwater Animal Breeding, Ministry of Agriculture/Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center of Hubei Province, Wuhan 430070, China)

The aim of this study was to isolate the potential probiotics and to identify their effects. Using spot inoculation as the first screening and the Oxford cup method as the second screening, we isolated a strain of bacterium, namely Dec-43, from the intestinal tract of Chinese softshell turtle (). This strain had antagonistic effects on bacterial strains including,and. The analysis in bacterial morphology, physiology, and biochemistry indicated that Dec-43 shared the same physiological and biochemical properties with. We used universal primers to amplify the 16S rRNA gene with PCR, and obtained a segment of 1448 bp from the total genomic DNA of Dec-43. After the sequencing and the BLAST analysis of this segment we found that the homology between Dec-43 andwas 99%. These results suggested that the Dec-43 should be. By conducting the single factor test we determined that the optimal growth temperature of Dec-43 was 36℃; the optimal salinity was 0.6%; the optimal initial pH was 7; the optimal growth inoculum size was 10%. Through the orthogonal experiment we also determined the proper carbon (glucose) and nitrogen (peptone) contents should be 15 and 10 g/L respectively.

Intestinal tract of Chinese softshell turtle (); Probiotics; Antagonism;; Growth characteristics

10.7541/2015.39

Q939.1

A

1000-3207(2015)02-0294-07

2014-04-21;

2014-07-25

国家科技支撑计划(2012BAD25B00); 淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心课题(2013PY070); 国家自然科学基金(31472310)资助

张棋(1989—), 男, 湖北松滋人; 硕士研究生; 主要研究方向为水产微生物学。E-mail: zhangqi1989@webmail.hzau.edu.cn

陈孝煊(1962—), 男, 福建连江人; 教授; 主要从事水生动物病害研究。E-mail: chenxx@mail.hzau.edu.cn