人M2型丙酮酸激酶促进肾癌细胞生长

梅国徽 ，麦海星，梁迎春，张柯，郭靖，李玲，董倩，洪甜，徐小洁，叶棋浓，陈立军

军事医学科学院a.附属医院泌尿外科，北京 100071；b.生物工程研究所，北京 100850；c.科技部，北京 100850

丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）是糖酵解途径的关键酶之一，可以催化磷酸烯醇式丙酮酸产生丙酮酸。PK 有4 种同工酶，即PKL、PKR、PKM1、PKM2，其中PKM2 主要表达于胚胎及增殖活跃的细胞中，随着胚胎的形成，在红细胞和肝脏中分别由PKR 和PKL 取代，骨骼肌、心脏和脑组织中则表达PKM1[1-5]。1972 年，Imamura 发现在肝癌细胞中PKL异常转变为PKM2[3]。随后的研究表明，在乳腺癌[6]、膀胱癌[7]、结肠癌[8]、肺癌[9]、肾透明细胞癌[10]等肿瘤中都伴有PKM2 的高表达，且与肿瘤的发展与转移密切相关。

我们拟构建PKM2 的真核表达载体，并验证其对肾癌细胞系Caki-1 生长的影响，为进一步研究PKM2与肾癌发生发展的关系奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚肾293T 细胞由本室传代培养；人透明细胞癌细胞Caki-1 由解放军总医院赠送；人乳腺文库、pXJ-40-myc 载体为本室保存；限制性内切酶、PCR试剂、DNA 连接酶购自TaKaRa 公司；质粒提取、胶回收试剂盒购自Promega 公司；VigoFect 购自威格拉斯生物技术有限公司；DMEM 培养基购自Gibco 公司；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成；基因测序由北京博迈德科技发展有限公司完成。

1.2 myc-PKM2重组质粒的构建与测序

以人乳腺文库为模板，根据文献报道的PKM2序列合成上游引物（5'-CGGGATCCATGCCCCGGA GGGCGGAGAA-3'）和下游引物（5'-CCGCTCGAGT CAATCTCCCATCCGTTGATGTG-3'），PCR 扩增人的PKM2编码序列。扩增条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸2 min，31个循环后；72℃延长7 min；最后用胶回收PCR产物。

用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pXJ-40-myc 载体，10 g/L 琼脂糖凝胶电泳后，胶回收载体的大片段；将PCR 片段回收后再用BamHⅠ和XhoⅠ酶切，形成带有粘性末端的双链，用T4DNA 连接酶连接入pXJ-40-myc 载体；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态后，挑选克隆进行菌液PCR，选取阳性克隆培养并提取质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，酶切鉴定阳性的克隆送北京博迈德科技发展有限公司测序。

1.3 细胞转染和Western印迹检测

用含双抗及10%胎牛血清的DMEM培养基将细胞接种于2块6 cm皿中，接种量以转染时60%～70%的细胞密度为宜，常规培养24 h 后行转染，转染前1 h 换液；将4 μL VigoFect 与200 μL NaCl 混合，在其静置5 min 的过程中，将10 μg 重组质粒与200 μL NaCl 混合，然后将上述2 种溶液混匀，室温孵育15 min 后滴入6 cm 皿中，以同种方法转染空pXJ-40-myc 载体作为对照；37℃、5% CO2条件下常规培养，转染4 h 后换液，24 h 后收集细胞，用1×PBS 溶液清洗1 次，4℃、3000 r/min 离心3 min 后弃上清，加入2 倍细胞量的RIPA 于冰上裂解30 min，加入等量2×SDS 上样缓冲液，煮沸15 min，12 000 r/min 离心3 min 后取上清液进行SDS-PAGE，湿转法转至硝酸纤维素膜上；用5%脱脂奶粉于常温封闭1 h，加入用5%脱脂奶粉以1∶2000 稀释的myc-HRP 鼠单克隆抗体，室温下轻摇1 h，用1×TBST 洗膜3 次，每次5 min；ECL 显色反应3 min，暗室压片显影。

1.4 生长曲线实验

pmyc-PKM2 质粒转染Caki-1 细胞24 h 后，与转染pXJ-40-myc 空载体的Caki-1 细胞同时以每孔3000 个细胞的密度接种于5 块96 孔板，每组设3 个复孔，分别在第0、1、2、3、4 d 加入100 μL 10%CCK-8后37℃孵育1 h，测定D450nm值，以培养时间为横轴、D450nm平均值为纵轴绘制生长曲线。

2 结果

2.1 myc-PKM2重组质粒的构建与鉴定

以本室保存的人乳腺文库为模板，PCR 扩增人PKM2 的编码序列，获得长约1500 bp 的DNA 片段，与预期大小一致（图1）。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后的PCR 产物和pXJ-40-myc 载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，挑克隆后进行菌液PCR 鉴定，若获得与目的条带1500 bp大小接近（图2）的克隆，则初步认为是带有人PKM2 基因的阳性重组克隆。将所得阳性克隆提质粒，经酶切鉴定，可切出2 条长度分别约为5000 和1500 bp 的条带，且相应的载体经酶切只见大片段，符合预期结果（图3）。DNA 序列测序结果表明，插入的DNA 序列与人PKM2 基因的编码序列完全一致（数据略）。

2.2 Western 印迹检测myc-PKM2 在293T 细胞中的表达

图1 PCR扩增人PKM2的编码序列

图2 重组质粒pmyc-PKM2的菌液PCR结果电泳图谱

将构建的pmyc-PKM2 重组质粒和空载体分别转染293T 细胞系，24 h 后提取蛋白进行SDSPAGE，Western 印迹检测myc-PKM2 的表达。结果显示，转染重组质粒后，用myc-HRP 抗体能在相对分子质量约60×103处检测到明显的特异性条带，而空载体无条带（图4）。

2.3 CCK8 法验证myc-PKM2 促进肿瘤细胞系的生长

将pmyc-PKM2真核表达载体及pXJ-40-myc 载体转染肾癌Caki-1 细胞，通过CCK8 法进行生长曲线实验。结果显示，myc-PKM2 能促进肾癌Caki-1细胞的生长（图5）。

图3 重组质粒pmyc-PKM2的BamHⅠ/XhoⅠ双酶切电泳图谱

图4 Western印迹检测融合蛋白的表达

图5 PKM2促进Caki-1细胞生长

3 讨论

1924 年Warburg 观察到，即使在氧气充足的条件下，肿瘤细胞依然通过糖酵解途径获取能量，而非有氧呼吸，这一现象被称为Warburg 效应或有氧糖酵解，是肿瘤细胞区别于正常细胞的特征之一。近年来的研究表明，PKM2 可能通过激活Warburg 效应促进了肿瘤的发生[11-14]。

PKM2 是PK 的同工酶之一，由PKM 基因编码。PKM 基因前体mRNA 经由核不均一核糖核蛋白（hnRNP）A1/A2 和多嘧啶序列结合蛋白（PTB）剪切拼接后可以形成PKM1 和PKM2，其中PKM1 包含外显子9，PKM2则包含外显子10[15-16]。PKM2主要在胚胎时期表达，在成人组织中多被其他同工酶替代，肿瘤组织中多伴有PKM1 向PKM2 的转变[17-19]。与PKM1不同，PKM2的催化活性受外显子10编码的一个特殊结构域调控，当与1，6-二磷酸果糖（FBP）结合时，可引起PKM2 二聚体的变构、结合，形成四聚体结构，这种PKM2 四聚体对磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）具有较强的亲和力和催化能力，可以促进糖酵解的进行；在不与FBP 结合时，PKM2 以二聚体形式存在，这种二聚体对PEP的催化能力较弱，从而引起糖酵解中间产物的累积，促进生物合成，支持细胞的生长和繁殖[20-21]。四聚体/二聚体的比例受一些代谢中间产物如FBP 的调节，PKM2 通过这一方式调控肿瘤细胞能量代谢与生物合成之间的平衡。近年发现PKM2 还具有调节基因表达、细胞周期进程的功能[22-23]。

PKM2 在多种肿瘤组织中过量表达，且在乳腺癌、结肠癌、泌尿系统肿瘤、胃肠道肿瘤患者的血清中可观测到PKM2 的升高。肾癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，Brinck通过免疫组化发现PKM2分布在正常肾脏的远曲小管和癌组织中，RT-PCR 显示癌组织中PK活性升高2～7倍[10]。Wechsel观察到，成功切除肾细胞癌后，血清PKM2 可在11 周内恢复到正常水平，而当肿瘤复发或转移时，血清PKM2 会再次升高，提示PKM2与肾癌关系密切[24]。

综上所述，我们构建的myc-PKM2 重组质粒在真核细胞中获得表达，且能够促进肾癌细胞系Caki-1 的生长。这为后续研究PKM2 在肾癌发生发展中的作用奠定了基础，有望为肾癌的诊断和靶向治疗提供新的思路。

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