白血病相关蛋白LRP16 过表达HepG2 稳定细胞系的构建及鉴定

李婷，王安平，李萍，王双双，母义明

解放军总医院 内分泌科，北京 100853

白血病相关蛋白16（leukemia related protein 16，LRP16）基因是韩为东等于1999年从正常人外周血淋巴细胞中克隆并命名的一个基因，属于Macro Domain 家族。该基因定位于染色体11q12.23，含11个外显子，编码325 个氨基酸残基构成的蛋白[1-2]。我们前期的研究表明，LRP16 基因对胰岛素分泌和胰岛素抵抗均有影响。它在脂肪细胞3T3-L1、肌肉细胞C2-C12、肝癌细胞HepG2 中发挥着重要作用，LRP16 过表达可上调多种炎性因子（TNF-α、IL-6）的表达，损伤IRS-1 信号传导通路（降低pIRS-1、PI3-K、pAkt 的表达），抑制细胞胰岛素刺激的葡萄糖摄取，引起外周胰岛素抵抗[3-5]。在这些研究中我们采用的是质粒转染的方式，这一技术一方面只能达到短期转染，另一方面转染效率较低。我们想深入研究LRP16 促进胰岛素抵抗的分子机制，希望获得长期稳定的LRP16 过表达细胞株。因此，我们构建了LRP16 过表达的慢病毒表达载体，且成功地感染了HepG2 细胞，获得稳定过表达LRP16 的细胞株，为深入研究LRP16 抑制肝脏胰岛素抵抗的相关机制提供相关技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK293T 包装细胞及人肝癌HepG2 细胞均购自中国医学科学院基础医学研究所北京协和细胞资源中心（CRC/PUMC）；过表达质粒载体EX-Y2069-Lv201 及对照质粒载体EX-NEG-Lv201（表1，图1）由OmicsLink 公司构建；慢病毒包装试剂盒Lenti-Pac HIV Expression Packaging Kit、Lenti-Pac HIV and FIV qRT-PCR 滴定试剂盒、第一链cDNA 合成试剂盒、2×All-in-One qPCR Mix 均购自Gene Copoeia 公司；MEM 培养基、DMEM 培养基、丙酮酸钠、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗均购自Gibco 公司；TRIzol 购自Invitrogen 公司；蛋白marker 购自Thermo公司；Western 印迹发光试剂盒购自北京普利莱公司；鼠抗人β-actin抗体购自Cell Signaling Technology 公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG购自中杉金桥公司；qPCR 引物由Invitrogen 公司合成；LRP16抗体由本实验室制备保存。

1.2 细胞复苏与培养

选用25 mL 培养瓶，适量HepG2 细胞，加入5 mL MEM 培养基（含10%胎牛血清、1%青链霉素、1 μmol/L 丙酮酸钠），于37℃、5% CO2培养箱中培养，2 d换液一次，4～5 d传代一次。

1.3 质粒载体构建及鉴定

对构建的过表达质粒载体EX-Y2069-Lv201 的LRP16 开放读框（ORF）进行测序，结果与人类LRP16基因（GenBank：NM_014067）序列相符。

1.4 慢病毒包装

按照Lenti-Pac HIV Expression 慢病毒包装试剂盒进行下述操作。在转染前2 d，按每个10 cm的培养皿1.3×106～1.5×106细胞数将HEK293T 包装细胞接种于培养皿中，用含10%胎牛血清的DMEM 培养基于37℃、5% CO2孵箱中培养，使细胞在转染时达到70%～80%的密度；在去聚丙烯的试管中，取2.5 μg 病毒过表达质粒EX-Y2069-Lv201 和5.0 μL（0.5 μg/μL）Lenti-Pac HIV mix 稀释至200 μL 的Opti-MEM 内；取15 μL EndoFectin Lenti，在另一试管中用Opti-MEM 稀释至终体积为200 μL；将稀释的EndoFectin Lenti 反应物加入轻微涡旋含DNA 的试管中（添加顺序不可颠倒），然后将上述混合物转移到5 mL 圆底聚丙烯试管Falcon 中；把形成的DNA-EndoFectin 复合物直接加入培养皿，轻轻摇晃培养皿使复合物均匀分布；在37℃、5% CO2孵箱中孵育细胞过夜（8～14 h），用含2%～5%经热失活的胎牛血清和青霉素、链霉素的DMEM 培养基替换过夜的原培养基；加入1/500 体积的TiterBoost 反应物到培养基中，在37℃、5% CO2孵箱中继续孵育；经48 h转染，收集含假病毒的培养液到加盖的试管中，500 r/min 离心10 min 去除细胞碎片；进一步离心，用0.45 μm 孔径的滤器过滤HEK293T 细胞上清液，得到过表达病毒浓缩液LPP-Y2069-Lv201-400，分装小管放置于-80℃备用。同样步骤得到对照病毒浓缩液LPP-NEG-Lv201-100。

表1 载体克隆信息

图1 过表达质粒载体EX-Y2069-Lv201（A）及对照质粒载体EX-NEG-Lv201（B）信息

1.5 慢病毒滴度测定

HEK293T 细胞传代，24 孔板中每孔加入1×105细胞，体积为500 μL；次日准备10 支无菌Ep 管，每管加入90 μL 培养基，取待测病毒原液10 μL 加入第1 支管中，混合均匀，取混合均匀的第1 管液10 μL 加入第2 支管中，继续相同操作直到最后一管；选取所需细胞孔，吸去90 μL培养基，加入稀释好的病毒溶液，于37℃、5% CO2培养箱中培养；1 d后，加入新鲜培养基500 μL；小心操作；4 d 后抽提RNA，然后采用Lenti-Pac HIV and FIV qRT-PCR 滴定试剂盒提取总RNA，将RNA 逆转录为cDNA，实时定量PCR检测绿色荧光蛋白标记的慢病毒滴度。病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，即2/（1E-6）=2E+6 TU/μL，亦即2E+9 TU/mL。确保病毒滴度≥108TU/mL（LPP-Y2069-Lv201-400 为3.87×108TU/mL，LPP-NEG-Lv201-100 为6.25×108TU/mL），以便后续操作。

1.6 慢病毒载体感染HepG2细胞系

将HepG2 细胞计数后铺到6 孔板中培养，各孔加入2 mL MEM 培养基（含10%胎牛血清，1%青链霉素，1 μmol/L 丙酮酸钠），在37℃、5% CO2条件下培养24 h；铺板24 h 后，按照MOI=30，每孔加入相应目的基因慢病毒液LPP-Y2069-Lv201-400 和对照慢病毒液LPP-NEG-Lv201-100，混匀后于37℃、5% CO2条件下培养；感染48 h 后，观察慢病毒侵染结果，拍摄细胞荧光图片；用胰酶消化感染过的细胞并转移至6 孔板（每块6 孔板对应一种慢病毒，留出1 孔用于阴性对照细胞），以含1 μg/mL 嘌呤霉素的MEM 培养基（含10%胎牛血清，1%青链霉素，1 μmol/L 丙酮酸钠）进行药物筛选培养5～7 d，观察细胞存活情况和荧光图片，当细胞荧光图片与明场细胞相对应，则嘌呤霉素浓度可以减半进行培养；连续加药培养7 d后，嘌呤霉素浓度减半至0.5 μg/mL 继续培养，待细胞长满后收取细胞。

1.7 qPCR检测LRP16的mRNA表达

从细胞中提取RNA，定量，电泳确定其纯度。用第一链cDNA 合成试剂盒进行逆转录，用Gene Copoeia 公司试剂盒配置所推荐的反应体系后在PRISM 7300（ABI 公司）上进行qPCR 反应。根据LRP16 的基因序列设计PCR 引物（上游引物：5'-A GCTCTTTCACTCGGAGGATT-3'；下游引物：5'-TG GCAAAAGAAGAAGACAAAGC-3'）。以GAPDH 基因为内参，根据GAPDH 的基因序列设计PCR 引物（上游引物：5'-TGGGTGTGAACCACGAGAA-3'；下游引物：5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3'）。反应条件：95℃ 30 s 预变性；95℃ 5 s，60℃ 20 s，72℃10 s，40 个循环。目标基因mRNA 的相对含量通过ΔΔCt计算方法获得。

1.8 Western印迹检测LRP16的表达

用自制IP 缓冲液（0.15 mol/L NaC1，20 mmol/L Tris-HC1，10%甘油，0.1% NP-40）加入25×总蛋白酶抑制剂及用100×PMSF 配置的细胞裂解液，分别裂解过表达稳转株、对照稳转株和野生型（未转染）HepG2 细胞，4℃、12 000 r/min 离心后取上清作为样品，测定蛋白浓度，取等量蛋白样品进行SDSPAGE 后转印蛋白至PVDF 膜，用以TBST 液配制的5%脱脂奶粉于室温封闭2 h，LRP16 鼠抗以1∶200稀释，β-actin 鼠抗人以1∶1000 稀释，4℃反应过夜，用TBST 液洗膜3 次，每次15 min，二抗以1∶5000 稀释，室温反应1 h，用TBST液洗膜3次，每次15 min，在膜上滴加发光液后进行曝光。

2 结果

2.1 慢病毒载体感染HepG2细胞株的筛选

按前述方法将HepG2 细胞计数后铺到6 孔板中培养，每孔加入目的基因慢病毒液LPP-Y2069-Lv201-400 和对照慢病毒液LPP-NEG-Lv201-100，感染48 h 后，观察慢病毒侵染结果，拍摄细胞荧光图片（图2）。可以看出，转入LPP-Y2069-Lv201-400 和LPP-NEG-Lv201-100 慢病毒后的HepG2 细胞，其绿色荧光蛋白表达超过90%。

2.2 过表达慢病毒感染HepG2 细胞后对LRP16 基因表达的影响

提取过表达稳转株、对照稳转株和野生型（未转染）HepG2 细胞总RNA，采用实时荧光定量PCR 检测各组细胞的LRP16 相对表达量。结果显示，过表达稳转株LPP-Y2069-Lv201-400 中LRP16 目的基因的表达量为对照稳转株LPP-NEG-Lv201-100 的128.64倍（表2）。

2.3 HepG2 细胞的感染和Western 印迹分析LRP16蛋白的过表达效果

将获得的LRP16 基因过表达的HepG2 细胞、过表达对照细胞及野生型HepG2 细胞分别培养4～5 d，在培养皿中加入适量细胞裂解液提取蛋白，用上清液行SDS-PAGE，转膜后进行蛋白免疫印迹分析。结果显示空白组和对照组细胞在相对分子质量约28×103处均出现了微弱条带，而过表达组出现明显的粗黑条带，表明过表达稳转株LPP-Y2069-Lv201-400 的LRP16 表达量明显高于对照稳转株LP-NEG-Lv201-100和野生型HepG2（图3），结果与实时荧光定量PCR一致。

表2 qPCR检测过表达稳转株、对照稳转株及野生型HepG2细胞中LRP16 mRNA水平

图2 LRP16过表达稳定株（A）及对照稳定株（B）荧光转染情况

图3 Western印迹检测LRP16蛋白表达的差异

3 讨论

前期，我们做了大量LRP16相关研究，发现它是机体发育过程中不可或缺的一个基因，其表达不仅与肿瘤的发生发展密切相关[6-7]，也参与了胰岛素的分泌及胰岛素外周器官的胰岛素抵抗作用。

随着糖尿病发生率的上升，胰岛素抵抗一度成为近年的研究热点，胰岛素通路受到重视。而我们发现的LRP16 基因参与胰岛素抵抗立刻引起了关注。但目前我们的发现大多停留在表明现象，真正所涉及到的机制研究甚少。

因为肝脏是胰岛素发挥作用的重要外周器官，而且之前我们也曾在肝癌HepG2 细胞系中研究过LRP16的作用，所以，在深入研究LRP16基因对胰岛素信号通路的影响机制时，我们仍然选用这一常用的肝癌细胞系。此LRP16 基因过表达的HepG2 稳定细胞系的建立，为我们今后的研究提供了一个长期有效的研究工具。

[1]韩卫东,于力,楼方定,等.一个新的白血病相关基因LRP16全长cDNA 的克隆、序列分析及表达特征[J].中国生物化学与分子生物学报,2001,17(2):209-204.

[2]于力,韩卫东,楼方定,等.新的白血病相关基因LRP16 的克隆[J].军医进修学院学报,2000,21(2):81-84.

[3]臧丽,吕朝晖,汪保安,等.LRP16 通过下调PPARγ表达抑制细胞葡萄糖摄取[J].中华内分泌代谢杂志,2010,26(3):217-220.

[4]臧丽,母义明,吕朝晖,等.LRP16基因抑制IRS-1信号通路和过氧化物酶体增殖物激活受体γ转录活性导致C2-C12 成肌细胞胰岛素抵抗[J].中华医学杂志,2011,91(20):1408-1412.

[5]臧丽,母义明,吕朝晖,等.人白血病相关蛋白16 基因对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取及过氧化物酶体增殖物激活受体γ活性的影响[J].中国糖尿病杂志,2011,19(4):293-297.

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