MTA1 基因表达与下咽癌颈淋巴结转移的关系

程阳，唐桥斐，赵丽妮

(1.沈阳医学院基础医学院病理生理学教研室，辽宁 沈阳 110034;2.附属第二医院耳鼻咽喉科;3.基础医学院药理学教研室)

MTA1基因最初是1994年Toh等［1］应用13762NF 鼠乳腺癌转移系统通过差异cDNA 文库筛选分离的转移候选基因。既往的临床研究表明MTA1 基因的高表达与食道癌［2］、直肠癌［3］、肝癌［4］、胰腺癌［5］、胃癌［3］、乳腺癌［6］、卵巢癌［7］的侵袭和转移相关;目前对该基因在下咽癌的组织中的表达情况及与下咽癌的淋巴结转移的关系的研究鲜见，本实验检测了MTA1 mRNA 在下咽癌组织中的表达情况，探讨其表达水平与下咽癌颈淋巴结转移的关系及临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料来源 选取解放军四六三医院耳鼻咽喉科2012年1 月至2014年3 月下咽癌住院手术病例，共17例。其中梨状窝癌12例，环后区癌2例，下咽后壁区癌3例。其中男15例，女2例，年龄34～85 岁，按国际抗癌协会(UICC)TNM 分类标准(1997)修订的方案，其中T 分级按国际抗癌协会(UICC)TNM 分类标准(1997)，N 分级按术后病理结果划分。各组均无远隔器官转移。全部病例组织学类型均为鳞癌。见表1。全组病例均行手术治疗，术前未接受放疗及化疗。取下咽部正常黏膜组织8例(术中取正常切缘，全组病例均行颈廓清术，选择性廓清2例，根治性廓清15例。经HE 染色证实为正常黏膜)作为对照。

表1 下咽癌T、N 分级情况

1.2 取材方法 术中切取新鲜离体癌组织癌灶中心部分，大小约0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm 组织块。下咽正常组织取自安全缘以外，体积同上。将各组织块分别投入1.5 ml Eppendorf 管，立即置入－179 ℃液氮中速冻，并转入－80 ℃深冻冰箱中保存备用。对下咽癌颈廓清标本，通过透明淋巴结摘出连续切片法［8］进行病理观察，确定转移组和非转移组。

1.3 试剂及仪器 逆转录试剂盒Super-script Tm(Promega 产品)。引物序列:MTA1 为5'-AGC-TACGAG-CAG-CAC-AAC-GGG-GT-3'，5'-CAC-GCT-TGGTTT-CCG-AGA-GT-3'，内对照 β-actin:5'-ACCCCG-ACT-GAA-AAA-GAT-GA-3'，5'-ATC-TTCAAA-CCT-CCA-TGA-TC-3' (上海博亚生物技术有限公司/BIOASIA 产品)。其它耗损材料均购自Promega 公司。PCR 扩增仪:PTC-200TM 型 (美国)。

1.4 检测方法 本研究采用逆转录－聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)方法。

1.4.1 RNA 的提取 从每一个Eppendorf 管中分别取0.1 g 冰冻组织，在低温下迅速粉碎，采用Trizol 试剂(Promega 产品)，一步法提取总RNA，按说明书进行。

1.4.2 RT-PCR (1)应用逆转录试剂盒Superscript Tm，按说明书操作逆转录合成cDNA 第一链。反应条件:4 ℃1 h，99 ℃5 min，4 ℃保存。反应体系:RNA (1 μg)2 μl，10 × RT buffer 2 μl，25 mmol/L MgCl24 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，AMV 逆转录酶(15 U)0.75 μl，Rnasin Ribonuclease Inhibitor 0.5 μl，OligodT primer (0.5 μg)1 μl。(2)加ddH2O 稀释至100 μl。(3)PCR 扩增:以逆转录产物为模板，进行PCR 扩增。反应体系:cDNA 3 μl，10 ×PCR 缓冲液2 μl，25 mmol/L MgCl21.2 μl，Taq 酶 (5 U/ml)0.4 μl，MTA1 引 物(上下游)10 μmol/L 各0.5 μl，内对照β-actin 引物各0.5 μl，加ddH2O 至20 μl。于PCR 扩增仪循环30个周期。扩增条件:94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，最后一个周期延伸9 min，4 ℃保存，β-actin 为内对照同时扩增。

取PCR 产物7 μl，于8%聚丙酰胺凝胶电泳分离，乙醇固定，硝酸银染色，观察结果并拍照记录。MTA1 及β-actin 的扩增片段分别为290 bp 和540 bp。

1.5 统计学方法 采用SPSS 10.0 统计软件进行相关统计分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

经RT-PCR 方法检测后，在290 bp 处显带的为MTA1 基因，可见在下咽癌转移组和不伴转移组中均有MTA1 mRNA 的表达，而在正常黏膜组织组中无MTA1 mRNA 的表达。MTA1mRNA 在下咽癌转移组表达阳性率为90.9% (10/11);在不伴颈淋巴结转移的其它下咽癌组织及8例癌旁正常黏膜中MTA1 mRNA 的表达率分别为33.3%(2/6)和0%。转移组的表达率与其他2 组差异有统计学意义(P ＜0.01)。作为内对照的β-actin 为540 bp，表达恒定。见图1 和图2。

图1 MTA1 mRNA 在标本中的表达情况

3 讨论

图2 内对照β-actin 在标本中均有恒定表达

2000年Nawa等［9］在人类的2 种乳腺癌转移系统中同时发现mta1 相关序列MTA1。后者与前者有很大的相似处，核苷酸和氨基酸序列分别有88%和90%的一致性。应用荧光原位杂交方法发现MTA1 基因定位于染色体14q32.3［10］;MTA1 基因在具有浸润性的细胞株中的表达水平是不具有浸润性的细胞株的2 倍［1］;抗MTA1 基因的反义寡核苷酸可以抑制高表达MTA1 基因mRNA 的乳腺癌细胞发生转移，并呈剂量依赖性关系［11］。

Toh等［3］研究表明，MTA1 mRNA 在38.9%的直肠癌中有过表达现象;在38.2%的胃癌中也同样发生了过度表达现象，并且伴随着升高的淋巴结转移率;半定量RT-PCR 结果显示，MTA1 mRNA 的表达水平在发生转移的癌组织与无转移的癌组织和癌旁正常黏膜相比，差异有统计学意义;随后Toh等［2］在食道癌中的研究结果同上，说明除了腺癌、鳞癌中也存在MTA1 mRNA 过表达的现象。

本研究结果表明，在17例下咽癌转移组的癌组织中，MTA1 mRNA 表达阳性率为90.9% (10/11);在不伴颈淋巴结转移的下咽癌组织及8例癌旁正常黏膜中MTA1 mRNA 的表达率分别为33.3% (2/6)和0%。转移组的表达率与其他2组差异有统计学意义 (P ＜0.01)。说明MTA1 mRNA 的表达与下咽癌颈淋巴结转移密切相关。本研究与文献报道的结果都证实了MTA1 基因的表达差异与肿瘤淋巴结转移显著相关，证明了MTA1 基因是一个有巨大潜在临床价值的指标，若应用于临床实践，可以帮助诊断下咽癌的颈淋巴结转移。

MTA1 基因产物可能通过调节细胞转录水平来参与肿瘤的侵袭与转移［12］;MTA1 促进肿瘤细胞发生转移的另一种可能机制是通过基因表达的改变使细胞间连接发生缺失，同时，基因表达的改变或基因使肿瘤细胞的恶性程度发生改变，演变为具有侵袭和转移能力的状态，使肿瘤细胞易发生转移［13］。但到目前为止，MTA1 基因参与转移过程的确切机理尚未研究清楚。

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