凉血止痒合剂抗Ⅳ型变态反应的实验研究

张旭杨瑾叶建州

（云南省中医医院皮肤科，昆明650000）

凉血止痒合剂抗Ⅳ型变态反应的实验研究

张旭杨瑾叶建州*

（云南省中医医院皮肤科，昆明650000）

目的探讨院内制剂凉血止痒合剂抗Ⅳ型变态反应的作用。方法采用2，4-二硝基氟苯（DNFB）造成变应性接触性皮炎（ACD）动物模型和磷酸组胺所致豚鼠瘙痒实验，探讨凉血止痒合剂的抗Ⅳ型变态反应作用。结果凉止痒合剂对DNFB引起的小鼠耳廓肿胀有显著的抑制作用，并有显著提高磷酸组织胺致豚鼠局部皮肤瘙痒的致痒阈值的作用。结论凉止痒合剂具有抗Ⅳ型变态反应的作用。

Ⅳ型变态反应；凉血止痒合剂；动物实验

Ⅳ型变态反应，亦称为迟发型超敏反应（Delayed Type Hypersensitivity，DTH）引起的皮肤疾病包括接触性皮炎、湿疹等［1］。凉血止痒合剂由云南省中医医院已故名老中医刘复兴主任自拟荆芩汤（紫草、生地黄、牡丹皮、赤芍、荆芥、枯黄芩）加入刺蒺藜、制首乌、生黄芪、九里光、昆明山海棠等化裁而来，具有清热凉血、祛风止痒、养血活血作用，主要用于血热型皮炎湿疹类皮肤病［2］。本文通过动物实验，验证该药的抗Ⅳ型变态反应作用。

1 实验材料

1.1 实验动物昆明种小白鼠，清洁级，40只，雌雄各半，体重18～22 g。购自昆明医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（滇）2005-0008；合格证号：0013106。健康豚鼠，清洁级，30只，雌雄各半，购自昆明医科大学动物室，许可证号：SCXK（滇）2005-0008；合格证号：0021861。

1.2 药物凉血止痒合剂，滇药制字（Z）20081880A，100ml/瓶，云南省中医医院院内制剂，由云南省中医医院制剂室提供。醋酸地塞米松片，0.75 mg/片，浙江仙琚制药股份公司，国药准字：H33020822，批号：130644。

马来酸氯苯那敏片（扑尔敏片）：4 mg/片，昆明振华制药厂有限公司，批号：20130501。0.9%氯化钠注射液，国药准字H52020069，250 mL/瓶；贵州天地药业有限责任公司出品，批号A13061504。

1.3 主要试剂及仪器磷酸组胺：成都艾科达化学试剂有限公司生产，批号：201305011，分析纯。2，4-二硝基氟苯（DNFB）：武汉福鑫化工有限公司，批号：201206012，分析纯。8 mm耳肿打耳器YLS-Q4，购自山东省医学科学设备站。NewClassic MF电子分析天平：梅特勒-托利多（METTLER TOLEDO）公司生产。

1.4 给药剂量凉血止痒合剂，生药含量为79 g/100ml，经人和动物的等效剂量系数换算，标准体重小鼠给药剂量为20.57 g/kg，标准体重豚鼠给药剂量为12.25 g/ kg。醋酸地塞米松片，小鼠给药剂量为0.01 g/kg［3］。扑尔敏片，豚鼠给药剂量为24 mg/kg［4］。主要试剂配制，以4∶1的丙酮:橄榄油配成0.5%、0.2%两种浓度，现用现配。

2 实验方法

2.1 凉血止痒合剂对ACD动物模型影响

2.1.1 实验动物分组、给药与造模［5］健康昆明种小鼠，40只，雌雄各半，随机（随机数字表法）分成4组，分别为空白对照组，模型组，阳性对照组（醋酸地塞米松组），凉血止痒合剂组。除空白对照组、模型组给予等体积生理盐水外，阳性药组醋酸地塞米松组每日给药量为0.01 g体重，按照人和动物的等效剂量系数计算，标准体重小鼠给药剂量为20.57 g/kg，共给药7 d［3］。实验前一天在腹部固定部位3 cm×3 cm用剪刀及剃须刀去毛。实验第1、2天致敏期于去毛部位涂0.5%DNFB，每天1次，每次20 μl，第3、4、5天不涂药，第一次致敏后的第6天，用0.2%DNFB溶液20 μl涂抹在小鼠左耳两面进行免疫攻击。右耳单涂丙酮：橄榄油（4∶1）溶剂作为对照；涂耳24 h后处死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径为8 mm的耳肿打耳器分别在两耳相应部位打孔，电子天平称重。

2.1.2 观察指标计算诱发后左右耳组织块重量之差。

耳重量：于诱发24 h后处死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径8 mm的耳肿打耳器在耳中部打孔，取下相同大小的组织块，称取其重量。用分析天平称得每个组织块的重量。计算诱发后左右耳组织块重量之差。

2.2 凉血止痒合剂对磷酸组织胺致痒作用的影响

2.2.1 目的了解凉血止痒合剂对磷酸组织胺致痒作用的影响。

2.2.2 分组、给药、造模［6］与检测指标豚鼠30只，雌雄各半，随机（随机数字表法）分为模型组，阳性对照组（扑尔敏组），凉血止痒合剂组。除模型组给予等体积生理盐水外，阳性药组给药剂量为每日24 mg/kg，根据人和动物的等效剂量系数折算，凉血止痒合剂组给药剂量为12.25 g/kg，连续用药7 d［4］。于实验前1h剪去右后足背毛，用细砂纸轻轻擦伤，使之发红，但不出血为度，面积约2 mm2。各组灌胃给药或生理盐水30 min后，用0.01%磷酸组织胺0.05 mL/只，此后每隔3 min依0.02%、0.03%、0.04%……递增浓度，每次均为0.05 mL/只，直至出现豚鼠回头舔右后足背，以最后出现豚鼠回头舔右后足背时所给予的磷酸组织胺总量（μg）为致痒阈值，记录并比较各组的致痒阈值。

3 统计方法

使用SPSS18.0统计软件。计量资料均使用（x±s）表示。两独立样本的计量资料比较若呈正态分布，并具有总体方差齐性，则采用t检验，若不具有总体方差齐性，则使用t’检验。两组以上数据比较若具有总体方差齐性则采用单因素方差分析，多组数据间的两两比较使用Least-Signfieant-diffrne（LSD）方法；两组以上数据比较若不具有总体方差齐性，则使用Kruskal-Wallis H秩和检验，两两比较使用Mann-Whitney U秩和检验。以上统计方法，均以P＜0.05为具有统计学意义。

4 实验结果

4.1 凉血止痒合剂对ACD动物模型影响

表1 空白对照组与模型组耳片重量值的比较

表1 空白对照组与模型组耳片重量值的比较

注：经t’检验，与空白对照组比较，1）P=0.000＜0.05

组别例数耳片重量值（g）空白对照组100.0140±0.0019模型组100.0407±0.00481）

小鼠诱发皮炎后耳重量差的比较，见表2，模型组、阳性对照组和凉血止痒合剂组两两之间比较，具有统计学意义。

表2 凉血止痒合剂DNFB所致小鼠迟发型超敏反应的影响

表2 凉血止痒合剂DNFB所致小鼠迟发型超敏反应的影响

组别模型组阳性对照组凉血止痒合剂组例数10 10 10剂量（g/kg）-0.01 20.57给药途径耳片重量差值（g）i.g.0.0259±0.0047 i.g.0.0187±0.0074 i.g.0.0156±0.0069

经单因素方差分析，三组间比较，P=0.004＜0.05，说明三组间有显著性差异；再使用LSD方法进行比较：（1）模型组与阳性对照组比较P=0.018＜0.05，说明两组有统计学意义（2）模型组与凉血止痒合剂组比较P=0. 001＜0.05，说明两组有统计学意义；（3）阳性对照组与凉血止痒合剂组比较P=0.295＞0.05，说明两组间无统计学意义。

4.2 凉血止痒合剂对磷酸组织胺致痒作用的影响

表3 涂抹磷酸组织胺次数及累计用量（致痒阈）

表3 涂抹磷酸组织胺次数及累计用量（致痒阈）

组别模型组阳性对照组凉血止痒合剂组例数10 10 10剂量（g/kg）-0.002 12.25给药途径致痒阈（mg）i.g.52.0000±22.5093 i.g.91.5000±29.6320 i.g.98.0000±32.9309

经单因素方差分析，三组间比较，P=0.003＜0.05，说明三组间有统计学意义；再使用LSD方法进行比较：（1）模型组与阳性对照组对比P=0.005＜0.05，说明两组有统计学意义；（2）模型组与凉血止痒合剂组比较P=0.001＜0.05，说明两组有统计学意义；（3）阳性对照组与凉血止痒合剂组比较P=0.617＞0.0.5，说明两组间无统计学意义。

5 讨论

凉血止痒合剂和醋酸地塞米松连续灌胃给药7天后，均对DNFB所致小鼠迟发型超敏反应有一定的抑制作用，两组与模型组比较有统计学差异（P＜0.05）。凉血止痒合剂组和阳性对照组比较没有统计学差异（P＞0.05），说明凉血止痒合剂与醋酸地塞米松片均具有抗炎作用。

凉血止痒合剂组和扑尔敏连续灌胃给药7天后，均能明显提高豚鼠致痒阈，两组与模型组比较有统计学意义（P＜0.05），说明凉血止痒合剂与扑尔敏均具有拮抗外源性组织胺的作用。

Ⅳ型变态反应是由T细胞介导的针对皮肤接触的抗原产生的迟发型变态反应（DTH）。实验用DNFB建立小鼠ACD模型，从而引起Ⅳ型变态反应，把小鼠耳廓作为皮炎的靶部位，根据炎症耳廓的厚度来判断抗皮炎药物的疗效。实验提示，凉血止痒合剂可以明显抑制小鼠耳肿胀程度，推测其作用机理可能与调节细胞因子，减少T细胞的释放，调节恢复免疫平衡有关，因而具有较明显的抗Ⅳ型变态反应的作用。

瘙痒是变态反应性皮肤疾病常见症状之一，其发病机制研究尚不完全清楚，可能与诸多因素有关，有大量研究表明，组胺是一种可以引起皮肤瘙痒的重要介质［7］，主要储存在嗜碱粒细胞和肥大细胞的颗粒内，由在组氨酸脱羧酶作用下的组氨酸脱羧而成。在临床上作为治疗靶点，组胺受体的H1、H2亚型已广泛应用，H3、H4在近年来也先后被研发克隆［8］。在组胺诱导瘙痒的过程中H1受体起到了重要作用，当组胺和H1受体相互作用时，可产生平滑肌收缩痉挛、毛细血管扩张、管壁通透性增加、腺体分泌增多等生理现象，因此H1受体被认为是过敏症状产生的靶点［9］。实验采用外源性组胺诱发豚鼠瘙痒的方法，结果提示，凉血止痒合剂组和阳性药组对组胺所致豚鼠局部的皮肤瘙痒均有抑制作用，与模型组比较，豚鼠局部致痒阈值明显提高（P＜0.05）；故凉血止痒合剂有抗瘙痒的作用。推测凉血止痒合剂止痒的作用机制可能是：①抑制肥大细胞脱颗释放组胺等炎症介质；②产生了类似H1受体拮抗剂的作用，通过竞争与H1受体结合，从而抑制了组胺与靶点的相互作用，使其无法表达生理活性，进而达到抗过敏止痒的效果。

凉血止痒合剂具有较为明确的抗Ⅳ型变态反应的作用，但其确切的作用机理还有待进一步的研究。

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叶天士巧治外孙天花

清代梁章钜的《浪迹丛谈续谈三谈》与徐珂的《清稗类钞》都记载了一代名医叶天士给自己外孙治病的奇闻逸事。

叶天士一外孙，刚满一岁就染上了天花，痘闭不出，高热昏迷，呼吸急迫。叶天士之女神色慌乱，抱着孩子回娘家，一生活人无算的父亲成为她最后的希望。哪知叶天士一看到病怏怏的外孙，就感叹太晚了。叶女很气愤，以头撞门，“父亲您作为姑苏城数一数二的名医，曾经说过小儿痘疹没有死证，难道只有您的外孙活不过今天吗？女儿我只好先走一步了”。说完，又拿起一把剪刀，朝向自己的脖子刺去。叶天士不得已，承诺一定会尽力把孩子抢救过来，叶女这才放下了剪刀。叶天士坐在书桌旁，苦思冥想，终于想出了一个办法。脱光孩子的衣服，放在一间闲置很久的空屋子里，就外出赌博去了。叶女想看看儿子到底怎么样了，但是门上锁了打不开，多次派下人督促父亲赶紧回家，可是叶天士玩得正在兴头上，毫无归意，叶女哭得死去活来。直到深夜，叶天士才回家，点上灯，开了锁，看到外孙痘疹遍布全身，粒粒如珠，高热已退。原来，此时正是三伏天，空屋子里蚊子嗡嗡叫个不停，接二连三叮咬孩子皮肤，痘疹发出来了。

——摘自《中国中医药报》

Experimental Study on Liangxue Zhiyang mixture against Delayed Type Hypersensitivity

ZHANG Xu，YANG Jin，YE Jianzhou.
（Department of Dermatology，Yunnan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Kunming650000，China）

Objective To investigates the antiallergic and the anti-inflammatory function of Liangxue Zhiyang mixture.Methods Through ACD induced by DNFB and experiment of guinea pig pruritus induced by Histamine Phosphate，found the pharmacodynamic mechanism and function of Liangxue Zhiyang mixture.Results Liangxue Zhiyang mixture had effect on the treatment of mice ear-swollen induced by DNFB.Conclusion It indicates that Liangxue Zhiyang mixture with a good anti-allergic and anti-inflammatory function and anantipruritic effects through the animal experiments.

delayed type hypersensitivity；Liangxue Zhiyang mixture；animal experiment

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.06.072

1672-2779（2015）-06-0142-03

杨杰 本文校对：杨杰

2015-03-02）

*通讯作者：kmyjz63@sina.com