2型糖尿病大鼠肝脏胰岛素受体表达的变化和丝胶的作用*

刘东慧，刘美晓，侯丽娜，宋成军，陈志宏

（承德医学院人体解剖学教研室，河北承德 067000）

2型糖尿病大鼠肝脏胰岛素受体表达的变化和丝胶的作用*

刘东慧，刘美晓，侯丽娜，宋成军△，陈志宏△

（承德医学院人体解剖学教研室，河北承德 067000）

目的：研究2型糖尿病大鼠肝脏胰岛素受体（insulin receptor，IR）表达的变化及丝胶的保护作用。方法：36只SD大鼠随机分为正常对照组、糖尿病模型组和丝胶治疗组3组，每组12只大鼠。采用链脲佐菌素连续腹腔注射法制作2型糖尿病大鼠模型，待模型成功建立后，丝胶治疗组大鼠给予丝胶（2.4g/kg/d）灌胃35d。采用葡萄糖氧化酶法检测各组大鼠的空腹血糖，Western Blotting法和RT-PCR检测大鼠肝脏IR蛋白和mRNA的表达。结果：与糖尿病模型组大鼠比较，丝胶治疗组大鼠肝脏IR蛋白和mRNA的表达明显升高（P＜0.01）。结论：丝胶可能通过上调2型糖尿病大鼠肝脏IR的表达在降血糖中发挥作用。

丝胶；2型糖尿病；肝脏；胰岛素受体（IR）；血糖

胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，其发挥作用的过程即是生物信号发出、转导和实现的过程。生理情况下，胰岛素与胰岛素受体（IR）结合后，使胰岛素受体底物的酪氨酸磷酸化，才能进一步引起胰岛素信号转导通路下游分子的级联反应，从而发挥胰岛素的生理功能［1］。近来研究发现，2型糖尿病胰岛素信号转导障碍是发生胰岛素抵抗的重要原因，而IR是胰岛素信号转导通路中的关键分子之一［2-3］。本研究观察了丝胶对2型糖尿病大鼠肝脏IR表达的影响，以期探讨丝胶是否通过影响肝脏IR的表达发挥降血糖作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组和处理 清洁级雄性SD大鼠36只，合格证号712024，体质量200-250g，购自河北医科大学实验动物学部。将大鼠随机分为3组：正常对照组、糖尿病模型组和丝胶治疗组，每组12只。糖尿病模型组和丝胶治疗组大鼠采用2%链脲佐菌素（STZ，25mg/kg，3d）连续腹腔注射法建立糖尿病动物模型，以注射STZ一周后空腹血糖≥16.7mmol/L作为成模标准。模型成功建立后，模型组大鼠不做任何处理；丝胶治疗组大鼠给予丝胶（2.4g/kg/d）灌胃35d。

1.2 药品与试剂 STZ，美国Sigma公司；IR兔抗大鼠多克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司；小鼠抗β-actin单克隆抗体，美国Santa Cruz公司；Trizol，美国Invitrogen公司；IR引物，上海生工生物工程有限公司；RT-PCR试剂盒，北京天根生化科技有限公司。

1.3 取材和指标检测 4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，经内眦于眶后静脉丛采血，离心取血清，采用葡萄糖氧化酶法检测血糖。大鼠取血后处死，取肝脏入液氮速冻后移入-80℃冰箱保存。

1.3.1 Western Blotting法检测肝脏IR蛋白的表达：取30mg保存肝脏匀浆提取蛋白。二喹林甲酸蛋白试剂盒确定蛋白浓度，8%积层胶和7%分离胶电泳，蛋白上样量为80μg，4℃、2mA/cm2转膜2h，5%脱脂奶粉封闭过夜，一抗（IR1：250，β-actin1：1000）室温孵育2h，滴加二抗（1：5000）1h后Super ECL Plus超敏发光液显影。胶片扫描后，采用Quantity One 4.6.2软件对显影条带进行分析，计算目的条带与β-actin条带的灰度比值，作为IR蛋白的相对表达水平。

1.3.2 RT-PCR法检测肝脏IR mRNA的表达：取100mg保存肝组织，在液氮中碾磨成粉末。按Trizol

总RNA抽提说明书操作，提取肝组织的总RNA。取3 μg总RNA为模板反转录成cDNA，反应条件为：42℃孵育3min；加入反应液Mix，42℃孵育15min；99℃反应3min。PCR反应条件：94℃，2min；94℃，30s；57℃，30s；72℃，1min，第2步起循环。PCR引物序列：IR，F：5′-AGAAGACCATTGATTCCGTGAC-3′，R：5′-GAGGTTGTG CTTGTTCCAGTC-3′；β-actin，F：5′-GAGAGGGAAATC

GTGCGTGAC-3′，R：5′-CATCTGCTGGAAGGTGGA CA-3′。PCR扩增条件：温度57℃；循环次数，IR 32次，β-actin 35次；IR产物305bp，β-actin产物452bp。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用ZF型紫外透射反射分析仪摄片，应用Quantity One 4.6.2软件进行定量分析，以目的条带吸光度与β-actin条带吸光度的比值，作为IR mRNA的相对表达水平。

1.4 统计分析 采用SPSS 19.0软件进行统计处理，组间计量资料的比较行t检验。

2 结果

2.1 各组大鼠的血糖 糖尿病模型组大鼠的血糖水平明显高于正常对照组大鼠（P＜0.01）；丝胶治疗组大鼠的血糖水平明显低于模型组（P＜0.01）。见附表：

附表 各组大鼠的血糖和肝脏IR的表达（±s，n=12）

附表 各组大鼠的血糖和肝脏IR的表达（±s，n=12）

与糖尿病模型组比较：*P＜0.01

组别 血糖（mmol/L） IR蛋白 mRNA正常对照组 10.83±2.03*1.168±0.025*0.661±0.013*糖尿病模型组 29.45±4.82 0.640±0.024 0.260±0.005丝胶治疗组 13.20±4.09*0.791±0.016*0.570±0.009*

2.2 各组大鼠肝脏IR蛋白和mRNA的表达 Western Blotting结果、RT-PCR结果见图1-2，定量分析结果附表：与正常对照组大鼠比较，糖尿病模型组大鼠肝脏IR蛋白和mRNA的表达明显降低（P＜0.01）；与糖尿病模型组大鼠比较，丝胶治疗组大鼠肝脏IR蛋白和mRNA的表达明显升高（P＜0.01）。

图1 大鼠肝脏IR蛋白的表达

图2 各组大鼠肝脏IR mRNA的表达

3 讨论

2型糖尿病是一种常见的因体内胰岛素分泌相对或绝对不足引起的以糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱为特征的慢性内分泌代谢性疾病，以胰岛素抵抗和胰岛分泌功能不全为主要病理表现［4］。近来研究发现，2型糖尿病胰岛素信号传导障碍是发生胰岛素抵抗的重要原因，而IR和其底物是胰岛素信号传导通路中的关键分子［2-3］。

本研究发现，2型糖尿病模型大鼠肝脏IR的表达明显降低。有研究显示，不论是IR还是其受体，它们数量、亲和力和结构的改变，都可导致胰岛素信号转导异常，影响葡萄糖转运载体-4对葡萄糖进行正常的跨膜运载，进而导致血糖升高［5］。本研究结果与胰岛素抵抗机理研究中，在IR水平IR基因表达下调或基因突变造成IR数量减少，致使胰岛素敏感性下降引起胰岛素抵抗的理论相一致［6］。由此推测，IR表达水平的改变触发了胰岛素信号转导通路的异常变化，进而可能引起信号转导通路下游信号效应蛋白的改变。

丝胶为约占蚕茧25%的水溶性蛋白，本研究根据民间蚕茧泡水降血糖的验方，提取了蚕茧中的丝胶并用于2型糖尿病模型大鼠，结果发现2型糖尿病大鼠经丝胶治疗后，血糖水平明显降低、肝脏IR的表达水平明显提高。因此提示，丝胶可能通过上调2型糖尿病大鼠肝脏IR的表达，改善胰岛素信号转导通路的异常变化，进而改善下游级联信号的传导，从而发挥降血糖的效应。

［1］Nathan DM， Buse JB， Davidson MB， et al. Medical management of hyperglycemia in type 2 diabetes： a consensus algorithm for the initiation and adjustment of therapy： a consensus statement of the American Diabetes Association and the European Association for the Study of Diabetes［J］. Diabetes Care， 2009，32（1）：193-203.

［2］Muoio DM，Newgard CB. Mechanisms of disease：molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes［J］.Nat Rev Mol Cell Biol， 2008， 9（3）： 193-205.

［3］Liu Bei， Sun Jian-ping， Zhao Yang， et al. Effect of chalcones extracted from angelica keiskei on the mRNA expression of insulin receptor and insulin receptor substrate-2 in hepatocytes of rats with type 2 diabetes［J］.Acta Nutrimenta Sinica， 2013， 35（1）：44-47.

［4］赵大鹏，隋艳波，栾仲秋，等.洋参御糖方对糖尿病大鼠糖脂代谢的干预作用［J］.中医药信息，2013，30（2）：44-45.

［5］Jiang H， Torregrossa AC， Potts A， et al. Dietary nitrite improves insulin signaling through GLUT4 translocation［J］. Free Radic Biol Med， 2014， 67： 51-57.

［6］钱俊文，柴可夫.加减抵当汤对胰岛素抵抗大鼠肝脏胰岛素受体基因表达的影响［J］.浙江中医药大学学报，2007，31（3）：295-298.

CHANGES OF INSULIN RECEPTOR IN LIVER OF TYPE 2 DIABETES MELLITUS RATS AND ACTIONS OF SERICIN

LIU Dong-hui， LIU Mei-xiao， HOU Li-na， et al

(Department of Human Anatomy, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To study the changes of insulin receptor （IR） expression in liver of type 2 diabetes mellitus rats and protective actions of sericin. Methods:36 male SD rats were randomly divided into the following 3 groups （n=12）：normal control group， diabetes model group and sericin treatment group. The rats with type 2 diabetes mellitus were induced by continuous intraperitoneal injection of streptozotocin. After successfully establishing diabetes rats model， the rats in sericin treatment group were lavaged with sericin （2.4g/kg/d） for 35 days. Glucose oxidase was used to detect the fasting blood glucose； Western Blotting and RT-PCR were used to detect the IR protein and mRNA expression in the liver of rats. Results: Compared with rats in diabetes model group， the IR protein and mRNA expression in liver of rats in sericin treatment group increased obviously （P＜0.01）. Conclusions: One of the mechanisms of sericin decreasing blood glucose maybe secrin can upregulate IR expression in liver of type 2 diabetes mellitus rats.

Sericin； Type 2 diabetes mellitus； Liver； Insulin receptor （IR）； Blood glucose

R587.1

A

1004-6879（2015）03-0188-03

2014-12-16）

* 国家自然科学基金项目（81441133），河北省自然科学基金项目（H2013406096），河北省高校重点发展学科“人体解剖与组织胚胎学”建设项目资助