敲低膜联蛋白A7对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响*

田焕娜，吴雪艳，王小杰

（承德医学院，河北承德 067000）

敲低膜联蛋白A7对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响*

田焕娜，吴雪艳△，王小杰

（承德医学院，河北承德 067000）

目的：观察靶向敲低人乳腺癌MCF-7细胞膜联蛋白A7（AXNA7）的表达对MCF-7细胞凋亡的影响。方法：实验分为3组，以靶向ANXA7的siRNA转染MCF-7细胞为siRNA干扰组，另设阴性对照组、空白对照组，采用RT-PCR法和Western blot法检测转染后MCF-7细胞ANXA7的表达情况，应用流式细胞术检测ANXA7低表达对MCF-7细胞凋亡的影响。结果：转染后，siRNA干扰组细胞ANXA7的表达明显低于阴性对照组和空白对照组（P＜0.05）；敲低ANXA7后，MCF-7细胞凋亡明显增加（P＜0.05）。结论：ANXA7低表达可促进乳腺癌细胞MCF-7凋亡。

膜联蛋白A7（AXNA7）；乳腺癌MCF-7细胞；凋亡

膜联蛋白A7（Annexin A7，AXNA7）是膜联蛋白家族成员，该家族具有典型的磷脂结合、Ca2+通道形成等特性［1］。有研究显示，AXNA7参与细胞的多种生物学行为，在膜转运、细胞分化、凋亡、生长调节及钙离子信号途径等方面发挥广泛的功能［2］。多种肿瘤组织ANXA7的表达发生了变化，提示ANXA7表达异常与多种肿瘤的发生发展相关［3-4］。乳腺癌是严重威胁妇女生命健康的常见恶性肿瘤之一，有研究发现ANXA7与乳腺癌关系密切［3］。本研究拟采用RNA干扰技术敲低乳腺癌MCF-7细胞ANXA7的表达，观察ANXA7低表达对乳腺癌细胞凋亡的影响，以期为乳腺癌的临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 MCF-7细胞购自上海中科院细胞库。β-actin鼠抗单克隆抗体，美国Santa Cruz公司；ANXA7鼠抗单克隆抗体、DMEM细胞培养基、胎牛血清、siRNA试剂、脂质体LipofectamineTM2000、细胞总RNA提取试剂盒，美国? Invitrogen公司；蛋白定量试剂盒，上海生工生物工程有限公司。

1.2 细胞培养 乳腺癌MCF-7细胞于含10%胎牛血清的DMEM中，5% CO2、37℃孵箱中常规培养。

1.3 细胞转染和实验分组 转染前一天将细胞种植于6孔板中，使细胞在24h内达到40-60%的密度。按照脂质体LipofectamineTM2000试剂说明书进行转染，按siRNA oligo 20pml/孔、脂质体5☒l/孔，分别将siRNA oligo和脂质体加入无抗生素、无血清的DMEM培养液250☒l中混匀，静置5min；然后将两液混合，室温放置20min；将500☒l脂质体/siRNA混悬液逐滴加入培养板，轻轻混匀，置于培养箱；转染后6h更换为含血清的培养基。其中转染靶向ANXA7 siRNA的细胞为siRNA干扰组、转染阴性siRNA的细胞为阴性对照组，空白对照组不做处理。

1.4 RT-PCR法检测ANXA7 mRNA的表达 细胞转染48h后，Trizol法提取细胞总RNA后，以其为模板使用反转录试剂盒进行反转录，获得cDNA。分别对目的基因和β-actin进行PCR检测。参照Genebank各基因序列的编码区，所用引物：ANXA7上游引物 5' AAAGGTGCTGGCACAGATGAC 3'，下游引物为5' TGGCCCACAATAGCCAGAAG 3'，扩增的基因片段长度为176bp；β-actin上游引物5' TGGCACCCAGCA CAATGAA 3'，下游引物 5' CTAAGTCATAGTCCG CCTAGAAGCA 3'，扩增的基因片段长度为186bp。反应体系20☒l，反应条件为：预变性95℃，2min；95℃30s；58℃ 30s；72℃延伸30s；共28个循环。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后采用ZF型紫外透射反射分析仪摄片，应用Quantity One V 4.52软件进行分析，以ANXA7条带与内参β-actin条带的灰度比值作为ANXA7 mRNA的相对表达水平。

1.5 Western blot法检测ANXA7蛋白的表达 细胞转染48h后，用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；一抗为ANXA7鼠抗人单克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，ECL检测。同时检测相应细胞β-actin的表达作为内参照。应用Quantity One V4.52软件进行分析，以目的蛋白条带与内参蛋白条带灰度比值作为ANXA7蛋白的相对表达水平。

1.6 流式细胞仪分析细胞凋亡 细胞转染48h后，收集各组细胞，预冷的PBS轻轻洗涤3次，将细胞重悬于500☒l预冷的结合缓冲液中，调整细胞密度为2×106/ml。取500☒l细胞悬液于流式管中，加入5☒l Annexin V混匀，室温下避光孵育10min，上机前5min加入10mg/L碘化丙锭（PI）染液5☒l。流式细胞仪检测细胞的凋亡情况，重复3次。

2.1 siRNA沉默ANXA7的效果 细胞转染后48h，siRNA干扰组细胞ANXN7蛋白和mRNA的表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组（P＜0.05）。提示siRNA能有效降低MCF-7细胞ANXA7的表达水平（图1-2，附表）。

2.2 ANXA7低表达对MCF-7细胞凋亡的影响 细胞转染48h后，siRNA干扰组细胞的凋亡率明显高于阴性对照组和空白对照组（P＜0.05），提示沉默ANXA7能够促进乳腺癌MCF-7细胞的凋亡。见附表。?

图1 MCF-7细胞ANXA7蛋白的表达

图2 MCF-7细胞ANXA7mRNA的表达

附表 MCF-7细胞ANXA7的表达情况和凋亡情况（±s，n=3）

附表 MCF-7细胞ANXA7的表达情况和凋亡情况（±s，n=3）

与阴性对照组和空白对照组比较：*P＜0.05

组别 ANXA7 凋亡情况（%）蛋白 mRNA siRNA干扰组 0.58±0.09*0.49±0.07*4.54±0.09*阴性对照组 2.19±0.15 1.99±0.13 0.97±0.06空白对照组 2.34±0.17 2.11±0.12 0.99±0.07

3 讨论

乳腺癌是全球范围内妇女最常见的恶性肿瘤之一，每年世界范围内女性乳腺癌的发病人数高达120万以上，死亡人数达50万以上。虽然欧美等西方国家是乳腺癌的高发区，但目前我国乳腺癌的发病率也逐年上升，并且发病年龄呈现年轻化的趋势。乳腺癌常在淋巴结、骨髓、肺等组织形成转移瘤，转移复发成为提高乳腺癌患者生存率的主要障碍。

AXNA7是膜联蛋白家族最早发现的成员之一，在细胞中直接或间接与细胞浆和内膜系统相联系，与膜运输、细胞增殖等有关［5］。关于AXNA7基因与肿瘤相关性的机制研究表明，AXNA7基因表达水平的改变可累及DNA修复基因、肿瘤抑制基因和与凋亡相关的基因［6］。但ANXA7在肿瘤发生发展中的作用并无定论，在恶性胶质瘤、黑色素瘤和前列腺癌中，ANXA7可能是抑癌基因，然而在肝癌、胃癌、鼻咽癌、结直肠癌中，ANXA7可能是促癌基因［7］。因此，有必要进一步研究AXNA7在恶性肿瘤发生发展中的作用。

本课题组前期研究发现ANXA7低表达能促进宫颈癌Hela细胞、肝癌HepG-2细胞凋亡［8-9］。本研究进一步观察了siRNA干扰ANXA7表达后对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响，结果显示，敲低ANXA7后，MCF-7细胞的凋亡明显增加。本研究结果表明，ANXA7低表达能够促进MCF-7细胞的凋亡。但这种现象是通过何种作用途径和信号通路实现的，ANXA7是否与乳腺癌的侵袭和转移有关，均有待于深入研究。

［1］Creutz CE， Pazoles CJ， Pollard HB. Identif ication and purif ication of an adrenal medullary protein （synexin） that causes calciumdependent aggregation of isolated chromaff in granules［J］. J Biol Chem， 1978， 253（8）： 2858-2866.

［2］Jia L， Wang S， Cao J， et al. siRNA targeted against matrix metalloproteinase 11 inhibits the metastatic capability of murine hepatocarcinoma cell Hca-F to lymph nodes［J］. Int J Biochem Cell Biol， 2007， 39（11）： 2049-2062.

［3］Srivastava M， Bubendorf L， Raffeld M， et al. Prognostic impact of ANX7-GTPase in metastatic and HER2-negative breast cancer patients［J］. Clin Cancer Res， 2004， 10（7）： 2344-2350.

［4］Yadav AK， Renfrow JJ， Scholtens DM， et al. Monosomy of chromosome 10 associated with dysregulation of epidermal growth factor signaling in glioblastomas［J］. JAMA， 2009， 302（3）：276-289.

［5］宋丽萍，华子春，张欣，等.重组改良型人膜联蛋白的核素标记及体内显像的实验研究［J］.中国现代医学杂志，2010，20（17）：2579-2581，2586.

［6］Blackburn JS， Rhodes CH， Coon CI， et al. RNA interference inhibition of matrixmetalloproteinase-1 prevents melanoma metastasis by reducing tumor collagenase activity and angiogenesis［J］. Cancer Res， 2007，67（22）：10849-10858.

［7］Guo C， Liu S， Greenaway F， et al. Potential role of annexin A7 in cancers［J］. Clin Chim Acta， 2013， 423：83-89.

［8］李欣，陈雪，王小杰，等.膜联蛋白A7低表达对人宫颈癌Hela细胞系增殖与凋亡的影响［J］.解剖学报，2010，41（4）：572-575.

［9］王小杰，梁秀军，李欣.敲低膜联蛋白A7对人肝癌HepG2细胞Bcl-2和Bax表达的影响［J］.解剖学报，2014，45（6）：809-813.

EFFECTS OF AXNXA7 KNOCKDOWN ON APOPTOSIS OF BREAST CANCER MCF-7 CELLS

TIAN Huan-na， WU Xue-yan， WANG Xiao-jie
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To investigate low expression of Annexin A7 （ANXA7） on apoptosis of breast cancer MCF-7 cells by target-silencing ANXA7 expression. Methods:MCF-7 cells were grouped into siRNA interference group， negative control group and blank control group. RNA interference technology was used to transfect the siRNA targeted ANXA7 into MCF-7 cells to knock down expression of ANXA7. Western blot and RT-PCR was used to detect the expression of ANXA7 after transfection； Flow cytometry was used to detect effects of low expression of ANXA7 on apoptosis of MCF-7 cells.Results: The expression of ANXA7 in MCF-7 cells of siRNA interference group were obviously lower than negative control group and blank control group （P＜0.05）. The apoptosis of MCF-7 cells increased after knocking down expression of ANXA7（P＜0.05）.Conclusions: Low expression of ANXA7 can promote apoptosis of breast cancer MCF-7 cells.

Annexin A7 （ANXA7）； Breast cancer MCF-7 cells； Apoptosis

R737.9

A

1004-6879（2015）03-0193-03

2014-12-04）