蠲痹颗粒对兔膝骨关节炎软骨细胞凋亡的影响※

方春凤 吴 洋 李兆福 刘 涛 刘维超 狄朋桃*

（1云南省中医医院儿科，昆明650021；2云南省中医医院风湿科，昆明650021；3云南中医学院科技处，昆明650500；4云南省中医医院病理科，昆明650021）

蠲痹颗粒对兔膝骨关节炎软骨细胞凋亡的影响※

方春凤1吴 洋2李兆福3刘 涛4刘维超2狄朋桃2*

（1云南省中医医院儿科，昆明650021；2云南省中医医院风湿科，昆明650021；3云南中医学院科技处，昆明650500；4云南省中医医院病理科，昆明650021）

目的探讨蠲痹颗粒对兔膝骨关节炎软骨软骨细胞凋亡的影响，揭示其治疗骨关节炎（OA）的部分作用机制，为蠲痹颗粒方治疗OA提供理论依据。方法将42只新西兰兔采用改良Hulth法建立兔膝OA模型，造模后，随机分为假手术组、模型组、蠲痹颗粒组及阳性药（双醋瑞因）组。药物干预或灌生理盐水6周后，取出关节软骨，石蜡切片HE染色观察软骨组织镜下病理形态改变，免疫组化法检测软骨组织caspase-3表达水平，TUNEL法检测软骨细胞凋亡情况。结果蠲痹颗粒组和阳性药对照组兔膝关节软骨组织caspase-3蛋白的表达、软骨细胞凋亡率明显低于模型组，比较有统计学意义（P＜0.05）。结论蠲痹颗粒能下调caspase-3蛋白表达，抑制膝关节软骨细胞凋亡，可能是蠲痹颗粒治疗骨关节炎的作用机制之一。

蠲痹颗粒；膝骨关节炎；细胞凋亡；caspase-3；中成药疗法；痹证

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种关节退行性病变，指与遗传、创伤、内分泌、肥胖、年龄等多种因素相关的关节软骨降解，并伴有软骨皲裂、溃疡、脱失的关节疾病，主要发生于老年人，75岁以上人群80%患有OA［1］，是最常见老年病。其发病与人体于中老年以后，中气不足，气血失和，肝肾渐亏，营卫不和，或卫阳亏虚，感受风寒湿邪外侵，闭阻经脉有关，治疗以温阳、祛风、渗湿的药物为主。

蠲痹颗粒为全国第二批名老中医学术经验继承工作指导老师、云南省名老中医吴生元教授在继承著名中医学家吴佩衡学术思想及临床经验的基础上研究、总结而成，全方主要由附片、桂枝、麻黄、细辛、川芎、赤芍、羌活、黄芪等10余味药物组成，具有温阳通络、祛风散寒除湿之功，临床应用多年，疗效显著。故在蠲痹颗粒治疗骨关节炎取得良好疗效的基础上，从调控caspase-3蛋白表达水平及对软骨细胞凋亡影响的角度，阐明其防治膝OA发生发展的部分作用机理。

1 材料

1.1 动物健康新西兰兔42只，6月龄，体重1.5～2.5 kg，由昆明医科大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（滇）2011-0004。

1.2 药品蠲痹颗粒：规格15 g/袋（云南省中医医院制剂中心，滇药制字〈Z〉20082554A）；双醋瑞因胶囊：规格50 mg/粒，（昆明积大制药股份有限公司，国药准字J20100150）。

1.3 试剂和仪器原位凋亡检测试剂盒（ROCHE公司），caspase-3抗体（ENZO公司）。DS-Fi2显微镜、石蜡切片机、BM-Ⅷ生物组织包埋机、CS-VI型摊片烤片机、自动脱水机、冷冻台。

2 方法

2.1 兔膝OA模型制造蠲痹颗粒组、阳性药（双醋瑞因）组、KOA模型组均以改良Hulth法复制右膝OA模型。具体方法：丙戊酸钠注射液（0.8～1.0 ml/kg）麻醉，将兔仰卧固定于手术台，右膝关节局部脱毛、消毒，取膝关节内侧纵切口长约2 cm，逐层切开或钝性分离，找到内侧半月板后切除，显露前交叉韧带后切断，手术时避免损伤关节软骨面，行抽屉试验阳性后缝合术口，麻醉苏醒后放回兔笼，使动物自由活动。术后1周内每天肌肉注射青霉素钠20万u，每天追赶动物活动30分钟。4周后开始治疗。假手术组切开关节囊后缝合，不破坏关节内结构。

2.2 分组42只新西兰兔随机分为4组，即假手术组、膝骨关节炎（KOA）模型组各10只，蠲痹颗粒组、阳性药（双醋瑞因）组各11只。每组动物适应性喂养1周后开始实验。

2.3 给药术后4周开始给药，将药物蠲痹颗粒及双醋瑞因按兔与人用药量以Meeh Rubner公式换算等效剂量。假手术组、KOA模型组以生理盐水10mL灌胃，蠲痹颗粒组以5.4 g/（kg·d）（生药6.16 g/（kg· d））的水溶液10 ml灌胃，阳性药（双醋瑞因）组予双醋瑞因4.5 mg/（kg·d）溶于同体积蒸馏水，每日1次，给药6周。

2.4 标本制备实验第10周后，注入空气法处死大白兔，打开关节腔，肉眼观察关节软骨组织形态、色泽变化，取下右膝内侧胫骨软骨组织，放入10%磷酸缓冲福尔马林中固定。

2.5 指标检测

2.5.1 HE染色固定48小时后，流水冲洗，放入10% EDTA中脱钙，自动脱水机脱水，浸蜡，包埋，切片，HE染色，封片，显微镜下观察。

2.5.2 免疫组化法检测软骨组织caspase-3蛋白表达水平切片脱蜡至水，PBS冲洗3次，3%H2O2室温孵育10min，PBS冲洗3次，山羊血清封闭，滴加一抗（抗caspase-3）工作液，4℃孵化过夜，PBS冲洗3次，滴加生物素标记二抗工作液，37℃孵育20 min，PBS冲洗3次，滴加DAB显色，蒸馏水终止显色反应，自来水冲洗，苏木素复染细胞20 s、脱水、透明、封片，显微镜下观察。

2.5.3 TUNEL法检测软骨细胞凋亡切片脱蜡至水，浸入蛋白酶K工作液15 min，配制TUNEL反应混合液，PBS液冲洗2次，滴加50 μlTUNEL反应液，加盖，37℃下闭光和加湿反应60 min，PBS漂洗玻片3次，滴加POD转换液，PBS漂洗玻片3次，滴加DAB底物，PBS漂洗玻片，显微镜下观察。

2.6 统计分析数据统计分析采用SPSS18.0统计软件包，采用方差齐性检验后单因素方差分析，数据统计以（x±s）表示，以P＜0.05为显著水平。

3 结果

3.1 HE染色软骨组织镜下观察见图1。

3.1.1 假手术组关节透明软骨细胞分布均匀，排序整齐，各层细胞层次清晰，细胞饱满，细胞核圆润，底层（生发层）细胞较表层和中层细胞稍大，核浆比大，潮线完整。

3.1.2 模型组关节透明软骨表面结缔组织增厚，表层和中层软骨细胞数减少，细胞排列紊乱，细胞核固缩变形，中层软骨细胞柱状排列消失，底层细胞与假手术组无明显差异，潮线欠完整。

3.1.3 蠲痹颗粒组中层和底层软骨细胞数量较模型组增多，排列不规则，细胞变饱满，细胞核圆润，底层细胞核浆比大，潮线完整。

3.1.4 阳性药组中层和底层软骨细胞数量较模型组增多，排列不规则，细胞变饱满，细胞核圆润，底层细胞核浆比大，潮线完整。

图1 各组HE染色软骨组织镜下观察

3.2 蠲痹颗粒对兔KOA关节软骨细胞caspase-3表达结果切片中细胞胞浆呈棕色颗粒为caspase-3阳性细胞，即caspase-3表达，每张切片随机选取5个400倍视野，以caspase-3阳性细胞数占细胞总数的比例表示caspase-3阳性率。阳性率（%）=caspase-3阳性细胞数/细胞总数×100%。见表1。

表1 蠲痹颗粒对兔KOA模型caspase-3表达水平的影响（x±s）

3.3 蠲痹颗粒对兔KOA关节软骨细胞凋亡的影响切片中凋亡细胞核呈棕黄色颗粒，每张切片随机选取5个400倍视野，以阳性细胞数占细胞总数的比例表示细胞凋亡率。凋亡率（%）=凋亡细胞数/细胞总数×100%。见表2、图2。

表2 蠲痹颗粒对兔KOA模型软骨细胞凋亡水平的影响（x±s）

图2 各组治疗后切片细胞凋亡组织镜下观察

4 讨论

骨关节炎是一种以关节软骨变性、破坏、骨质增生为病理特征的慢性、进行性关节病变，病因病机尚不清楚，研究表明软骨细胞凋亡、细胞外基质的降解和软骨下骨的再造是导致OA软骨降解的主要原因［2］，而软骨细胞凋亡在OA发生发展中起到关键作用［3］。正常情况下，软骨细胞凋亡是一个正常的现象，软骨细胞的凋亡对于软骨的成熟和形态维持有着重要的作用，一旦软骨细胞凋亡过度，软骨细胞数量减少，引起细胞外基质合成减少，从而导致OA的发生。在软骨细胞凋亡过程中，caspase家族起着非常重要的作用，因caspase-3在凋亡信号转导过程中占据中枢位置，其活化与否决定了凋亡程序启动［4-5］，活化的caspase-3降解细胞内底物骨架蛋白、核蛋白、MEK激酶、PKA2等，通过细胞外和细胞内途径介导使细胞发生凋亡［6］。

骨关节炎属中医“痹证”范畴，《素问·痹论》：“风寒湿三气杂至，合而为痹，其风气胜者为行痹，寒气胜者为痛痹，湿气胜者为着痹……病在阴者命曰痹”，骨关节炎主要好发于老年人，正如《素问·上古天真论》所云“丈夫……，五八，肾气衰……；六八，阳气衰竭于上……；七八，肝气衰，筋不能动……。”步入老年后，人体机能减退，则肝肾不足、阳气渐衰，阳气失去维持正常的温煦生理功能，不能固密卫外，风寒湿相夹杂，侵袭机体，犯于经络、筋骨，邪气壅塞而成痹，阳气亏虚为发病的内在病理基础，故“阳虚外感风寒湿邪”是OA发生的关键病机所在。

蠲痹颗粒以附子辛苦大温、大热，通行十二经，具有温散寒湿、补火助阳之功为君药，吴佩衡《医药简述》：“附子温暖水寒，补命门真火，回阳生津，驱逐阴寒，回阳救逆”；桂枝、麻黄、细辛等辛温药物，功擅“祛风散寒、温经通阳”，黄芪益气固表，增强卫阳之卫外功能，川芎、赤芍活血通络、散瘀止痛，使闭阻邪气外出，经络通畅；配伍羌活、独活、海风藤、透骨草等祛风湿，全方药物配伍，共奏“温阳散寒、祛风除湿”之功。部分研究还显示黄芪能降低细胞凋亡率和Bim蛋白的表达，抵抗H2O2造成的体外软骨细胞损伤［7］，川芎可促进软骨细胞分泌合成代谢因子，刺激细胞增殖和蛋白质合成［8］。附子、独活、细辛有较好的抗炎、镇痛作用［9-11］。

本实验研究表明，蠲痹颗粒能下调caspase-3表达，阻滞凋亡信号转导，降低软骨细胞凋亡率，抑制关节软骨细胞过度凋亡。这可能是蠲痹颗粒延缓关节软骨退变，从而介导其对关节软骨保护作用的有效机制。参考文献

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The Influence of Juanbi Granule on Chondrocyte Apoptosis of Rabbit Knee Osteoarthritis

FANGChunfeng1，WU Yang2，LI Zhaofu3，LIU Tao4，LIU Weichao2，DI Pengtao2△
（1.Department of Pediatrics，Yunnan Provincal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Kunming650021，China；2.Department of Rheumatology，Yunnan provincal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Kunming650021，China；3.Department of Science and Technology，Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming650500，China；4.Department of Pathology，Yunnan Provincal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Kunming650021，China）

Objective To explore the influence of Juanbi granule on chondrocyte apoptosis of rabbit knee osteoarthritis，reveal partial treat mechanism of the osteoarthritis（OA），and provide the theory basis for treatment of OA.Methods 42 NewZeal and rabbits were used to establish improved Hulth model of knee OA.After the mould，the rabbits were randomly divided into control group，model group，Juanbi granule group and the positive drug group（double vinegar）.After six weeks intervention of drugs or physiological saline，the articular cartilage was removed.We observed the pathological morphological changes of HE dyeing cartilage tissue under the mirror，detected the caspase-3 expression level in chondrocytes by immunohistochemical method，and detected chondrocytes apoptosis by TUNEL method. Rusults The rabbit knee joint cartilage caspase-3 protein expression level and cartilage cell apoptosis rate of Juanbi granule group and positive medicine control group were significantly lower than those of the model group，and there was statistical significance（P＜0.05）. Conclusion Juanbi granule can cut the caspase-3 protein expression and cell apoptosis.This may be one of the mechanisms of Juanbi granule in treating osteoarthritis.

Juanbi granule；knee osteoarthritis；apoptosis；caspase-3；therapy of traditional Chinese medicine patent prescription；arthralgia syndrome

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.14.070

1672-2779（2015）-14-0136-03

：杨杰本文校对：汤小虎

2015-06-11）

国家中医药管理局云南吴佩衡扶阳学术流派工作室项目；云南省自然基金项目（No：2011FZ260）

*通讯作者：dipengtao88@126.com