桑树AKR2A伴侣蛋白基因的克隆及分析

刘 岩，沈国新，计东风，朱 燕，林天宝，吕志强

（浙江省农业科学院 蚕桑研究所，浙江杭州 310021）

桑树AKR2A伴侣蛋白基因的克隆及分析

刘 岩，沈国新，计东风，朱 燕，林天宝，吕志强*

（浙江省农业科学院 蚕桑研究所，浙江杭州 310021）

通过RACE等生物学技术，从桑叶中克隆获得AKR2A同源基因。cDNA全长1 488 bp，ORF长为1 050 bp，编码349个氨基酸。编码蛋白预测分子量为37.31 ku，等电点4.43；富含螺旋结构，与同类蛋白同源性较高。盐胁迫后AKR2A在根组织中表达量上升，在不同桑树品种叶片中表达丰度存在差异。

伴侣蛋白；AKR2A；桑树

高温会严重破坏植物细胞加工进程，影响蛋白降解，产生毒性非特异性反应。为此，植物进化出一种保护机制，其中包括产生大量热激蛋白（small heat shock protein，sHsps）应对胁迫［1］。这些蛋白具有分子伴侣活性，可阻止热胁迫诱导蛋白变性、非特异性降解。此外，这些蛋白也响应其他胁迫，调节植物生长发育。

AKR2A和AKR2B（ankyrin repeat-containing protein，AKR2）与GF14相互作用［2］，可识别叶绿体外膜蛋白信号，将它们转运至叶绿体外膜。植物外膜蛋白包含有一个N端跨膜结构域（transmembrance protein，TMD），需要一个叶绿体锚定信号。AKR2A能结合APX3侧翼结构域，充当APX3的分子伴侣蛋白，阻止翻译后APX3的降解，对植物生长代谢、发育都有重要作用［3-4］。目前拟南芥AKR2A蛋白已经有研究报道，为了对桑树AKR2A同源基因进行了解，开展与之相互作用蛋白的筛选，分析AKR2A对桑树生长发育与代谢的调控机制，本研究利用RACE等技术，克隆桑树AKR2A同源基因，并对其进行表达及生物信息学分析。

1 材料与方法

1.1 试验材料

实验用桑叶样品均采自浙江省农业科学院蚕桑研究所实验苗圃。

1.2 主要试剂

大肠杆菌Dh5α由浙江省农业科学院蚕桑研究所保存；5＇和3＇RACE试剂盒购自Clontech生物技术公司；RNA抽提、反转录试剂盒、PCR酶反应系统、T-Vector购自全式金生物有限公司；DNA胶回收试剂盒购自鼎国生物有限公司，测序和PCR引物均由上海生工生物工程公司完成。

1.3 桑叶RNA抽提及RT-PCR

采集新鲜桑叶，参照TransZol plant操作说明，抽提样品总RNA，紫外分光光度法测定总RNA浓度，并通过电泳检测抽提RNA纯度。每个RNA样品取500 ng，参照操作说明书步骤进行RT转录反应；根据NCBI数据库中登录的AKR2A序列信息，设计兼并引物对MaAKR2A-F（5＇-GGYARYGC NYTVATGCAGGA-3＇，其中Y=C/T；R=A/G；N=A/T/C/G；V=A/C/G）和MaAKR2A-R（5＇-TCRATTGMGCRCAYTTCAVCTC-3＇，其中R=A/G；M=A/C；Y=C/T；V=A/C/G）进行扩增。

PCR反应程序为：94℃预变性5 min，然后94℃变性1 m in，56℃复性1 min，72℃延伸30个循环，最后72℃延伸10 min。上述PCR产物经电泳后，割胶回收对应的产物，与Easy以适当的比例连接，转化E.coli TG1细胞，然后筛选鉴定阳性克隆，送交上海生工生物技术有限公司测序。

1.4 5＇-和3＇-RACE

根据Clontech公司试剂盒操作说明，1.5 min在上述测得的序列区域内分别设计用于5＇和3＇RACE的特异性引物GSP-AKR2-R（5＇-CTTCC CTCCGAATCTTCCTCGTCCT-3＇）和GSP-AKR2-F（5＇-GTCTTGCCGCTTCTGGTGATCCAGCTACTTC-3＇）分别进行两端RACE扩增，回收PCR产物，与Easy T以适当的比例连接，转化E.coli TG1细胞，然后筛选鉴定阳性克隆，送交上海生工生物技术有限公司测序。

根据RACE结果，设计扩增全长MaAKR2A基因的引物AKR2-ORF-F（5＇-ATGGCGTCTAATTCG CAGAAGGATTC-3＇）和AKR2-ORF-R（5＇-TTACAG GAAGGCATCCTTCTCGAGC-3＇），经克隆后测序。

1.5 生物信息学分析

将MaAKR2A基因cDNA序列提交NCBI数据库，与家蚕的全基因组序列进行BLAST比对，分析MaAKR2A基因的基本结构信息。通过软件CLUSTAL X（ver.1.83）推导出MaAKR2A cDNA编码产生的氨基酸序列，并对MaAKR2A蛋白的基本特性进行分析。蛋白序列提交Blast（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/），分析蛋白的保守结构域。将MaAKR2A的氨基酸序列提交https：// npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl？page =npsa-sopm.htm l，结合系统展现的蛋白的高级结构分析蛋白功能；并利用PHYLIP软件对MaAKR2A蛋白进行比对分析。

1.6 表达谱分析

1.6.1 对盐胁迫前后不同幼苗的转录表达分析

桑种子发芽长出2片真叶时，随机挑选10株置于100 mmol·L-1NaCl浸润滤纸的平皿中24 h，同时设置蒸馏水组为对照。分别采集处理前后，处理组、对照组根、茎、叶片样品，同上抽提 RNA并进行反转录。利用设计的引物AKR2A-F（5＇-CAAAATCCCCAGTTTATGACCA-3＇）和AKR2A-R（5＇-CCATTGCTTCACCCAACTTCT-3＇）进行定量PCR检测，并以MaActin的Actin-F（5＇-TGAAG GCTGGGTTTGCTGGT-3＇）和Actin-R（5＇-GCTCGT TGTAGAAAGTGTGATGC-3＇）引物对的扩增作为内参，按照全式金公司real-time PCR kit操作说明，在StepOne荧光定量PCR仪上进行定量PCR检测（美国ABI生物公司），按照2-△△Ct方法统计分析不同转基因纯化株系的表达。

1.6.2 对不同品种桑树叶片中AKR2A的转录表达水平分析

选取9个不同桑树品种，取同叶位叶片，分布抽提RNA，进行反转录后，利用定量检测引物按照全式金公司real-time PCR kit操作说明，在StepOne荧光定量PCR仪上进行定量PCR检测（美国ABI生物公司），按照2-△△Ct方法统计分析MaAKR2A的转录表达量。

2 结果与分析

2.1 M aAKR2A cDNA序列的克隆

根据AKR2A的保守区设计兼并引物，以此扩增获得MaAKR2A的保守序列片段。经3＇和5＇RACE扩增后，得到特异性扩增产物条带 （图1）。克隆相应序列，经拼接得到全长的MaAKR2A cDNA序列 （图2）。序列全长1 488 bp，含一个完整的开放阅读框编码349个氨基酸。

图1 MaAKR2A的扩增产物

2.2 桑树AKR2A基因的结构特点

经预测比较分析，桑树AKR2A编码蛋白分子量为37.31 ku，等电点p I为4.43.在C端含有ANK保守结构域 （图3），序列富含螺旋Helix结构 （图4）。

2.3 进化比较分析

桑树AkR2A蛋白与同类蛋白同源性较高，与桃树来源蛋白的（M5VQ6，Prunus persica）同源性最高，达85.4%；相对而言，与云杉 （A9NRF1，Picea sitchensis）的同源性最低，为69.1%，在不同品种间保守性较高 （图5）。

2.4 不同桑叶叶片AKR2A的表达谱活性

随机克隆5个品种桑树AKR2A基因的全长ORF序列，测序表明序列间无明显差异。选择9个品种桑树叶片，通过定量PCR分析发现，不同品种间表达量有较大差别，以围西、荷叶白、强桑和上清4个品种居高，另外台青、GM5、建水长穗桑、农桑14、8632桑品种中，该基因表达量显著低于前面4个品种 （图6）。

图2 MaAKR2A cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列

通过100 mmol·L-1NaCl盐胁迫杂交桑幼苗24 h后，分别取不同组织样品，以未胁迫正常组织为对照，通过定量检测发现，盐胁迫后根组织中AKR2A基因相对表达量上升，而叶、茎中相对表达含量略呈下降态势，但总体变化程度不大（图7）。

图3 MaAKR2A蛋白保守结构域分析

图4 MaAKR2A蛋白二级结构的预测

图5 不同品种来源AKR2A蛋白的进化分析

3 小结和讨论

膜蛋白的正确定位对真核蛋白功能的发挥起重要作用，膜蛋白通常有2种合成途径，一种是在内质网膜合成，在Sec61膜蛋白帮助下形成复合物，通过膜囊泡转运至目的地；另一种是在细胞质游离核糖体中，然后通过分子伴侣和受体蛋白锚定到靶膜上［5］。AKR2A是一种很重要的分子伴侣蛋白，与之相互作用的蛋白中，C端 （如APX3，APX5，CB5和TOM20）、N端（OEP7和CB5R）、靠近C端 （TOC34）均含有 ABS（AKR2A-binding sequence，ABS）。Zhang等［6］推测ABS在膜上位置不影响AKR2A功能，AKR2A与单一ABS结构域蛋白结合。AKR2A结合膜蛋白的ABS，可能在组织膜蛋白特异性受体作用下转运至指定位置。AKR2A含有4个C端的ankyrin repeats和一个N端PEST结构域［2］，前者是蛋白相互作用结构域，后者是指富含Pro，Glu，Ser和Thr，降解短寿命蛋白信号域。Shen等［4］报道AKR2A可以与APX3相互作用。本文克隆鉴定了桑树AKR2A基因，为今后围绕该基因开展桑树生长发育和代谢调控研究提供了理论基础。

图6 不同品种间MaAKR2A基因转录表达水平的比较

图7 NaCl胁迫后不同组织AKR2A基因表达量变化

本研究发现，盐胁迫后，相对于叶、茎组织而言，AKR2A基因在植物根组织中表达水平提高，这可能与盐离子进入质膜，根细胞代谢发生变化，需要更多的AKR2A参与调控各类胁迫响应蛋白；而Eugenia等［7］对胁迫条件下抗坏血酸的表达检测研究发现，植物损伤后前3 h内AKR2A表达量增加。另外，研究检测发现不同品种桑树AKR2A基因表达水平存在较明显差异，而AKR2A又能与APX3，Hsp17.8等发生相互作用，调节膜蛋白合成转运［8］，不同桑树品种AKR2A的表达调控及其与植物抗逆等性能的关系目前尚不清楚，尚待进一步调控和作用机制研究。

［1］ Liberek K，Lewandowska A，Zietkiewicz S.Chaperones in control of protein disaggregation［J］.EMBO Journal，2008，27：328-335.

［2］ Yan J，Wang J，Zhang H.A 14-3-3-interacting，ankyrin repeat-con taining protein p lays a role in both disease resistance and antioxidation metabolism［J］.Plant Journal，2002，29：193-202.

［3］ Mullen R T，Trelease R N.The sorting signals for peroxisomal memb rane-bound ascorbate peroxidase are within its C-terminal tail［J］.Journal of Biological Chem istry，2000，275：16337-16344.

［4］ Shen G X，Kuppu S，Venkataramani S，et al.ANKYRIN REPEAT-CONTAINING PROTEIN 2A is an essentialmolecular chaperone for peroxisomal memb rane-bound ASCORBATE PEROXIDASE3 in Arabidopsis［J］，Plant Cell，2010，22：811-831.

［5］ Abell B M，Pool M R，Schlenker O，et al.Signal recognition particle mediates post-translational targeting in eukaryotes［J］. EMBO Jou rnal，2004，23：2755-2764.

［6］ Zhang H，Li X，Zhang Y Z，et al.Is AKR2A an essential molecular chaperone for a class of membrane-bound proteins in plants［J］.Plant Signaling&Behavior，2010，5：1520-1522.

［7］ Eugenia L，Mary S K，Cawas E，et al.Expression profiling of ascorbic acid-related genes during tomato fruit development and ripening and in response to stress conditions［J］.Journal of Experimental Botany，2009，60：663-678.

［8］ Zhang H，Wang J，A llen R D，et al.Cloning and expression of an Arabidopsis gene encoding a putative peroxisomal ascorbate peroxidase［J］.Plant Molecular Biology，1997，34：967-971.

（责任编辑：张 韵）

S 888

A

0528-9017（2015）04-0553-05

10.16178/j.issn.0528-9017.20150435

2014-12-19

浙江省蚕桑农业新品种选育重大科技专项 （2012C12910）；浙江省蚕桑产业科技创新团队 （2011R50028）；家蚕基因组生物学国家重点实验室开放课题 （sklsgb2013015）；国家蚕桑产业技术体系-现代农业产业技术体系建设专项 （蚕桑）（CARS-22-ZJ0105）

刘 岩（1976-），女，河南人，副研究员，主要研究方向为桑蚕分子生物学。E-mail：mayanly@sina.com。

吕志强。E-mail：13958131715@139.com。

文献著录格式：刘岩，沈国新，计东风，等.桑树AKR2A伴侣蛋白基因的克隆及分析 ［J］.浙江农业科学，2015，56（4）：553-557.