生物炭对烤烟质体色素代谢的影响

杨永霞,张嘉炜,王 晶,冯小虎,崔 红*

1.河南农业大学烟草学院,郑州市农业路63号 450002

2.江西省烟草公司抚州市公司,江西省抚州市大公路115号 344000

生物炭对烤烟质体色素代谢的影响

杨永霞1,张嘉炜1,王 晶1,冯小虎2,崔 红*1

1.河南农业大学烟草学院,郑州市农业路63号 450002

2.江西省烟草公司抚州市公司,江西省抚州市大公路115号 344000

为揭示生物炭对烤烟质体色素代谢的影响机理,以烤烟品种K326为材料,从细胞组织结构、基因表达以及物质代谢三个层面进行了研究.细胞超微结构分析表明:中部叶成熟早期,添加300和600 kg/hm2生物炭烟叶类囊体片层数量较多,随着叶片成熟类囊体片层数量减少,不施用生物炭的对照烟叶类囊体片层数量减少更明显.基因表达分析显示:打顶后色素合成相关基因的表达逐渐减弱,色素降解相关基因的表达增强;添加300和600 kg/hm2生物炭,烟叶类胡萝卜素合成及降解相关基因表达相对较强.物质代谢分析表明:打顶后烟叶色素含量(质量分数)逐渐降低;添加生物炭后色素积累较多.中部叶成熟后期,添加300 kg/hm2生物炭的处理烟叶色素积累最多,随生物炭施用量的增加,烟叶色素积累减少并接近对照.添加300 kg/hm2生物炭的处理调制后烟叶色素降解产物及中性致香物质总量最高,而不施用生物炭的处理最低.因此,施用适量生物炭有利于成熟期烟叶色素的代谢及调制后烟叶中性致香物质的形成.

烤烟;生物炭;质体色素;物质代谢;细胞结构;基因表达

烟草质体色素是多种中性致香物质的前体物,与烤烟品质和香气风格密切相关[1].类胡萝卜素作为光辅助色素,不仅可以防止光氧化[2],其降解产生的香味物质也可直接影响烟叶品质和风格[3-4].烟草质体色素的合成与降解受多种因素影响,如品种、生态环境和栽培管理措施等[5-7].生物炭是利用特定的炭化技术,以自然界中广泛存在的生物质资源(如木材、家禽粪便和秸秆等)为材料,在lt;700℃的温度和无氧或限氧条件下热解而得到的一种细粒度、多孔性的碳质材料[8],其综合效应良好[9].有研究表明,土壤添加生物炭能够改变作物根系形态,提高根系生理活性和酸性土壤的pH,进而增强土壤肥力,维持植株适宜的根冠比,提高作物产量[10-11].此外,土壤添加生物炭还会影响土壤微生物群落组成以及氮循环尤其是销态氮的吸附、排放和转化,并减轻重金属积累[12-13].目前,在烟草上的研究主要集中在施用生物炭对植烟土壤理化性质及烟株经济性状的影响方面[14-15],而对烟叶细胞超微结构和物质代谢相关基因表达的影响则研究较少.为此,对植烟土壤施用不同量的生物炭,从烟叶细胞组织结构、基因表达以及物质代谢三方面进行系统研究,旨在为优质烟叶的生产提供依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

试验于2013年在江西省抚州市广昌县长桥镇进行.供试烟草品种K326,试验地土壤为水田砂壤土,其基本理化性状:有机质25.8 g/kg、碱解氮210 mg/kg、速效磷 10 mg/kg、速效钾 76 mg/kg、pH5.2.按照当地优质烟叶栽培技术规范进行管理,选取中部12叶位(从叶片发生2 cm时即为叶龄第1天)进行挂牌标记.添加的生物炭以花生壳、玉米秸秆为原材料,经过机械粉碎后装入程序控温马弗炉(KSW-4D-11,上海跃进医疗器械厂)中,在550℃的限氧热解状态下连续炭化3～4 h,冷却后粉碎,过75µm(200目)筛,即得所需的生物炭.试验设置4个处理:①常规施肥(CK);②在常规施肥的基础上增施生物炭300 kg.hm-2(T1);③在常规施肥的基础上增施生物炭600 kg.hm-2(T2);④在常规施肥的基础上增施生物炭900 kg.hm-2(T3).

1.2 试验方法

1.2.1 叶片超微结构的观察

参照文献[16]的方法在打顶后10、20、30和40 d时,用锋利刀片切取从叶尖向叶基数第6～8条支脉间1 mmX2 mm的叶片,迅速置于4%的戊二醛溶液中,抽真空固定并于4℃条件下保存,在透射电镜下观察并拍照.

1.2.2 质体色素基因表达分析

在打顶后10、20、30和40 d,选取生长发育良好的不同烟株的3片中部叶,于液氮中冷冻,后置于-80℃冰箱保存.采用Trizol法进行烟叶总RNA的提取,用随机引物法合成cDNA.利用Primer Premier5软件设计烟草质体色素基因扩增引物,L25为内参基因(表1),采用半定量RT-PCR进行基因表达差异分析.PCR反应体系为20 μL,PCR扩增程序为:94℃5 min;94℃30 s,50℃(退火温度根据引物不同而变化)30 s,72℃1 min,共35个循环;72℃10 min.采用1.0%琼脂糖凝胶进行PCR产物检测.

表1 引物序列

1.2.3 质体色素含量及相关降解产物的测定

打顶后质体色素取样时期和方法同1.2.2节基因表达分析.每个样品3次重复,冻干后备用.烤后烟叶按照国标分级[17],取C3F样品,分别用于质体色素及降解产物含量(质量分数)的测定.所有样品粉碎后过380µm(40目)筛.参照文献[16]进行烟株大田生长期及烤后烟叶质体色素含量(质量分数)的测定,参照文献[18]进行烤后烟叶质体色素降解产物含量(质量分数)的测定.

2 结果与分析

2.1 叶绿体超微结构的变化

电镜观察叶绿体超微结构(图1)显示,土壤添加不同量生物炭的处理烟叶细胞组织结构变化规律基本一致.在中部叶成熟前期,淀粉粒体积变化较小,嗜锇颗粒较为丰富,类囊体片层数量较多;处理间比较,以T1和T2处理的烟叶细胞类囊体片层数量较多.随着叶片的成熟,叶绿体被膜上的嗜锇物质明显减少、类囊体片层消失,细胞表现出衰老的特征.不施生物炭的CK烟叶细胞衰老特征更为明显,生物炭施用量越多,类囊体片层数量减少越慢,细胞衰老越缓慢.

图1 叶绿体超微结构

2.2 色素代谢途径关键基因的表达

图2 不同用量生物炭处理烟叶色素代谢相关基因表达差异的比较

如图2所示,打顶后随着叶片的成熟,各处理烟叶中与叶绿素和类胡萝卜素合成有关的镁离子螯合酶基因(Mg-chelatase,CHL,合成叶绿素镁分支的第一个关键酶)、八氢番茄红素合成酶基因(phytoene synthase,PSY,催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸向八氢番茄红素的转化)、ζ-胡萝卜素脱氢酶基因(ζ-carotene desaturase,ZDS,催化ζ-胡萝卜素向番茄红素的转化)和番茄红素-β-环化酶基因(lycopene-β-cyclase,LCYb,催化番茄红素转化为β-胡萝卜素)表达逐渐减弱,与降解相关的叶绿素酶基因(chlorophyllase,CLH,叶绿素分解代谢过程中的限速酶)、脱镁叶绿酸a加氧酶基因(pheophorbide a monooxygenase,PAO,催化叶绿素卟啉环开环生成四元线性吡咯衍生物的关键酶)和类胡萝卜素裂解双氧合酶基因(carotenoid cleavage dioxygenases,CCD1,降解类胡萝卜素的关键酶)的表达量维持较高水平.不同处理相比,随着生物炭施用量的增加,烟叶叶绿素和类胡萝卜素合成相关基因CHL、PSY、ZDS和LCYb的表达呈减弱趋势,而与降解相关基因的表达较强.综合来看,T1和T2处理中,类胡萝卜素合成及降解相关基因的表达整体较强.这说明施用生物炭,有利于烟叶质体色素尤其是类胡萝卜素的合成和降解,其中每公顷添加300和600 kg生物炭的处理效果较好.

2.3 质体色素含量分析

由图3可知,随着叶片的成熟,各处理烟叶叶绿素(叶绿素a和叶绿素b),以及类胡萝卜素(紫黄质、新黄质、叶黄素和β-胡萝卜素)含量变化趋势相同,随着生育期的推进,各处理烤烟质体色素含量均呈下降趋势.在烟叶成熟后期,添加生物炭处理的质体色素含量均高于对照.其中,添加300 kg.hm-2生物炭的处理T1烟叶色素含量下降平缓,叶绿素和类胡萝卜素色素积累最多.结合对叶绿体超微结构及打顶后色素代谢关键基因的分析结果,说明施用生物炭能不同程度地延缓叶片的衰老,叶绿素和类胡萝卜素代谢相关基因的表达相对更强,在成熟中后期烟叶叶绿素和类胡萝卜素积累较多,烟叶成熟期延长.

图3 不同用量生物炭处理烟叶质体色素含量的变化

2.4 烤后烟叶质体色素及相关降解产物含量

由图4可知,调制后烟叶,中性致香物质总量以及叶绿素降解产物新植二烯和类胡萝卜素类降解产物总量均为T1处理烟叶最高,对照最低.说明土壤中适当添加生物炭有利于烤后烟叶中性致香物质的形成.

图4 不同用量生物炭处理烟叶质体色素降解产物的变化

3 结论

对土壤中添加生物炭处理的烟叶细胞组织结构、基因表达以及物质代谢分析表明:①在中部叶成熟早期,添加300和600 kg.hm-2生物炭处理的烟叶细胞类囊体片层数量较多,随着烟叶成熟,不施用生物炭的处理类囊体片层数量减少较多;②随着生物炭施用量的增加,色素合成相关基因的表达减弱,降解相关基因的表达增强.添加300和600 kg.hm-2生物炭处理中,类胡萝卜素合成及降解相关基因表达相对较强;③打顶后烟叶色素含量逐渐降低.土壤添加生物炭处理后,烟叶色素积累较多.成熟后期,添加生物炭量高的处理,烟叶色素积累量越低.调制后添加300 kg.hm-2处理的烟叶色素降解产物及中性致香物质总量最高,而未添加生物炭的烟叶色素降解产物及中性致香物质总量最低.说明土壤中添加生物炭有利于成熟期烟叶色素的积累和调制后烟叶中性致香物质的形成.

[1] 韩锦峰.烟草栽培生理[M].北京:中国农业出版社,2003.

[2]Giuliano G,Tavazza R,Diretto G,et al.Metabolic engineering of carotenoid biosynthesis in plants[J].Trends Biotechnol,2008,26(3):139-145.

[3]Maldonado R G,Rodriguez B E,Sanchez C A,et al.Production of tobacco aroma from lutein,specific role of the microorganisms involved in the process[J].Appl Microbiol Biot,2003,62(5/6):484-488.

[4] 过伟民,尹启生,宋纪真,等.烤烟质体色素含量的品种间差异及其与感官质量的关系[J].烟草科技,2009(8):50-55.

[5] 赵宸楠,赵二卫,肖炳光,等.不同生态区烤烟质体色素生物合成规律及色素含量比较[J].西北农业学报,2010,19(12):68-71.

[6] 席元肖,魏春阳,宋纪真,等.不同香型烤烟化学成分含量的差异[J].烟草科技,2011(5):29-33.

[7] 过伟民,张艳玲,蔡宪杰,等.光质对烤烟品质及光合色素含量的影响[J].烟草科技,2011(9):65-70.

[8]Van Z L,Kimber S,Morris S,et al.Effects of biochar from slow pyrolysis of paper mill waste on agronomic performance and soil fertility[J].Plant and Soil,2010,327:235-246.

[9] 卜晓莉,薛建辉.生物炭对土壤生境及植物生长影响的研究进展[J].生态环境学报 2014,23(3):535-540.

[10]Antal M J,Gronli M.The art,science and technology of charcoal production[J].Ind Eng Chem Res,2003,42:1619-1640.

[11]张春,赵浩淳,郭涛,等.生物炭用量对烟苗生长的影响[J].烟草科技,2015,48(6):21-26.

[12]王丽渊,丁松爽,刘国顺.生物质炭土壤改良效应研究进展[J].中国土壤与肥料,2014(3):1-6.

[13]XU H J,WANG X H,LI H,et al.Biochar impacts soil microbial community composition and nitrogen cycling in an acidic soil planted with rape[J].Environ Sci Technol,2014,48(16):9391-9399.

[14]万海涛,刘国顺,田晶晶,等.生物炭改土对植烟土壤理化性状动态变化的影响[J].山东农业科学,2014,46(4):72-76.

[15]毛家伟,张翔,叶红朝,等.生物质炭对豫西烤烟生长、SPAD值及经济性状的影响[J].山西农业科学,2014,42(8):851-853.

[16]牛志强,杨永霞,刘国顺,等.湖北省不同生态区烤烟质体色素代谢差异研究[J].中国农学通报,2014,30(28):87-92.

[17]GB/T 2635-1992 烤烟[S].

[18]苏菲,杨永霞,史宏志,等.氮素营养协同成熟期同量调亏对烤烟质体色素和相关基因表达的影响[J].华北农学报,2013,28(4):145-151.

责任编辑 董志坚

Effects of Biochar on Plastid Pigment Metabolism in Flue-cured Tobacco

YANG Yongxia1,ZHANG Jiawei1,WANG Jing1,FENG Xiaohu2,and CUI Hong*1
1.Tobacco College,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China
2.Fuzhou Tobacco Company of Jiangxi Province,Fuzhou 344000,Jiangxi,China

To reveal the influence mechanism of biochar on the plastid pigment metabolism in flue-cured tobacco,the cell structure,gene expression and substance metabolism of cv.K326 were studied.Cell ultrastructure analysis indicated that:at the early mature stage of middle leaves,the thylakoid lamellae content in leaves treated by biochar application rate of 300 or 600 kg/ha was higher and decreased along with the development of tobacco leaves,and it decreased more obviously in the leaves without biochar application(the control).Gene expression analysis showed that:the expression of genes related to plastid pigment synthesis reduced gradually,while the expression of genes related to plastid pigment degradation increased after topping;and the expression of genes related to carotenoid biosynthesis and degradation was relatively stronger by biochar treatement at the rate of 300 or 600 kg/ha.Substance metabolism analysis suggested that:the plastid pigment content in leaves reduced gradually after topping;biochar application increased the plastid pigment accumulation in leaves.At the later stage of middle leaf maturing,the plastid pigment accumulation reached the highest in leaves treated by biochar at the rate of 300 kg/ha,while it decreased and was close to that in the control with the increase of biochar application rate.The contents of pigment degradation products and neutral aroma components in cured leaves treated by biochar at the rate of 300 kg/ha were the highest,while those in leaves without applying biochar were the lowest.Therefore,applying biochar at an appropriate rate is beneficial to the pigment metabolism in leaves at mature stage and the formation of neutral aroma components in cured leaves.

Flue-cured tobacco;Biochar;Plastid pigment;Substance metabolism;Cell structure;Gene expression

S359.2

A

1002-0861(2015)10-0026-05

10.16135/j.issn1002-0861.20151004

2015-04-17

2015-05-29

中国烟草总公司江西省公司科技项目quot;江西烟叶物质代谢规律及调控研究quot;(201201003).

杨永霞(1980-),博士,讲师,主要从事烟草生物技术研究.E-mail:yyx624@126.com;*

崔红,E-mail:cuihonger_13@163.com

杨永霞,张嘉炜,王晶,等.生物炭对烤烟质体色素代谢的影响[J].烟草科技,2015,48(10):26-30.YANG Yongxia,ZHANG Jiawei,WANG Jing,et al.Effects of biochar on plastid pigment metabolism in flue-cured tobacco[J].Tobacco Scienceamp;Technology,2015,48(10):26-30.