紫色杆菌素研究与开发进展

李 红,蔡友华,陆最青,郑彩珠

（广东肇庆星湖生物科技股份有限公司，广东 肇庆 526040）

紫色杆菌素是微生物的一种次级代谢产物，属于吲哚衍生物，由2个色氨酸分子氧化缩合而成，是一种非极性的蓝黑色素，微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和四氢呋喃等有机溶剂，一般选择乙醇作为紫色杆菌素的提取溶剂.1882年，Boisbaudran[1]首次发现紫色杆菌素.研究发现，紫色杆菌素具有很多重要的生物活性，在医药、食品和纺织等行业有广阔的应用前景.本文中，笔者对紫色杆菌素的生物合成分子机制、基因工程菌的构建及发酵、生物活性及其应用前景作一综述.

1 紫色杆菌素的生物合成

目前所发现的能产紫色杆菌素的微生物均属于细菌.19 世纪末，人们首次发现Chromobacterium violaceum 能够产紫色杆菌素[2-3]，随后，其他产紫色杆菌素的微生物也陆续被发现并分离出来，包括C.fluviatile，Alteromonas luteoviolacea，Pseudoalteromonas luteoviolacea,Pseudomonas sp.520P1 和Ps.sp.710P1，Duganella sp.B2，Jan th inobacterium lividum XT1.C.violaceum 作为最早发现产紫色杆菌素的菌株，其相关研究最为广泛，属于革兰氏阴性菌，是一种对动物和人类的机会致病菌，能够导致败血病.

紫色杆菌素的生物合成分子机制研究已取得了重要进展，早期研究发现高色氨酸浓度对菌体有损害作用，认为色素的合成与色氨酸的调控有关，通过研究色氨酸及吲哚衍生物对产紫色杆菌素的影响来推测其生物合成途径.Momen等[3]通过同位素示踪实验确定了紫色杆菌素中所有C，H，N原子均来自色氨酸分子.紫色杆菌素合成相关的基因及生物合成途径也已基本研究清楚.

2000年，C.volaceum 的生物合成基因簇克隆成功，长约9 kb[3].同时，August等[4]报道有4个基因（vio A，vio B，vio C，vio D）控制着紫色杆菌素的生物合成，但研究发现在E.coli 中表达这4个酶并不能将底物色氨酸转变成紫色杆菌素.2003 年，C.volaceum（ATCC12472）全基因组测序完成.2006 年，Sánchez 等[5]发现了紫色杆菌素合成相关的第5个基因vio E，至此，紫色杆菌素的整个合成代谢途径基本清楚.一个基因簇控制着整个紫色杆菌素的生物合成，长约7.3 kb，由5个基因组成（见图1），这5个基因有相同的转录方向.这5个基因编码紫色杆菌素合成相关的不同酶，根据这5种酶的催化顺序及其功能，由色氨酸出发，在生物体内经过5步酶促反应最终合成紫色杆菌素.紫色杆菌素及脱氧紫色杆菌素由于太不稳定以至于不能很好地进行分离纯化，因此，在5步酶促反应后还有一个氧化脱羧的非酶促反应过程，这2种产物转换成更稳定的构型.换言之，紫色杆菌素的整个生物合成途径包括2个独立的过程：一个是由5种蛋白酶vio ABCDE组成的酶催化过程；另一个是氧化脱羧的非酶催化过程.

图1 紫色杆菌素基因簇结构示意图

2 基因工程菌的构建及发酵

目前所发现的合成紫色杆菌素菌种的产量均很低（亚马逊河域菌株Chromobacterium violaceum 在最优条件下的产量为0.43 g/L[6]），且培养条件较为苛刻，限制了紫色杆菌素的产业化推广.近年来，紫色杆菌素合成的相关基因簇已经基本研究清楚，因此构建基因工程菌高效生产紫色杆菌素的研究正逐年增加.

1991 年，Pemberton等[7]从C.violaceum 中克隆紫色杆菌素生成合成基因簇，并将其在E.coli K12 中成功异源表达.有研究将pPSX-vio ABCDE转化至E.coli K12 DH5α，传至100代后质粒仍保持稳定性，但该工程菌生产紫色杆菌素水平较低.工程菌E.coli K12 DH5α PUC18-vio ABCDE 和Sphingomonas sp.JMP4092 pPSX-vioABCDE 合成紫色杆菌素能力虽然高，但质粒不稳定.为了构建得到稳定、高产的生产菌，Ahmetagic等[8]将pPSX-vioABCDE 转化至E.coli K12系列宿主菌，发现E.coli K12 JM101，JM105和JM109不仅具有紫色杆菌素的高产特性，而且具有高产稳定性.研究还发现，pPSX-vio ABCDE在启动子区域缺失一个碱基对后发生变异，得到的pPSX-vio ABCDE opv-1可使E.coli K12 DH5α过量生产紫色杆菌素并具有高稳定性.将高产菌株E.coli K12 JM109和高产质粒pPSX-vio ABCDE opv-1组合构建成一株稳定高产紫色杆菌素的工程菌E.coli K12 JM109 pPSX-vio ABCDE opv-1.2011年，Ahmetagic等[9]研究了紫色杆菌素生物合成基因簇在E.coli K12中的表达情况，结果表明E.coli K12能够合成紫色杆菌素，而且紫色杆菌素具有抑制E.coli的原生动物捕食特性.蒋培霞等[10]从新疆天山冰川土壤中分离出一株可合成紫色杆菌素的Dugane-lla sp.B2，通过对其紫色杆菌素生物合成基因簇进行分离、鉴定和克隆，并在不同的宿主如E.coli，Enterobacter aerogenes，Pseudomonas putida 和Citrobacter freundii 中进行表达，考察了基因工程菌生产紫色杆菌素的能力.研究发现，所构建的基因工程菌均能合成紫色杆菌素，但E.coli 合成色素的能力不如其他工程菌株.E.coli 在LB培养基中以色氨酸为底物，紫色杆菌素的产量最高达0.866 g/L.Pseudomonas putida 以色氨酸为底物，在LB 培养基中紫色杆菌素的产量达0.861 g/L，在E2 液体培养基中其色素产量可高达1.5 g/L.C.freundii 基因工程菌在初步优化条件下，紫色杆菌素的产量达到1.68 g/L，且该工程菌具有生长快、易培养和生物合成稳定性好等优点.这一研究证明了紫色杆菌素可在基因工程菌中异源高效合成.

基因工程菌的构建，除了功能基因或者基因簇的筛选，其表达质粒与宿主的匹配性也至关重要，再通过密码子优化、启动子工程等手段，能较好构建获得较强表达体系的工程菌株.

3 紫色杆菌素的生物活性

1942年，Lichstein等[11]发现紫色杆菌素粗提物对革兰氏阳性细菌具有显著的抑制作用.此后，国内外学者对紫色杆菌素的生物活性进行了大量研究和报道.经研究发现，紫色杆菌素具有多种生物活性，主要有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化4个方面的作用.

3.1 抗菌

Lichstein等[11]用51株细菌进行抗菌性实验，发现紫色杆菌素的主要作用是抑制革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌的抑制效果并不明显.Duran[12]发现，从巴西的Chromobacterium violaceum 纯化到的紫色杆菌素也具有抗革兰氏阳性菌活性.目前研究发现，紫色杆菌素可抑制金黄色葡萄球菌、链球菌、芽孢杆菌、分枝杆菌[13]、奈瑟球菌、假单胞菌等，但对黄杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、黏质沙雷菌、纳豆芽孢杆菌、魏氏梭菌不具有抑制作用.体外实验发现，高浓度（15 μg/mL）紫色杆菌素不仅抑制细菌生长，还能杀死细菌.紫色杆菌素抗结核分支杆菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为64 μg/mL和128 μg/mL.将紫色杆菌素制造成纳米粒子聚合物能增加其溶解性，抑菌效果更好.Vio 纳米粒子可以有效抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）ATCC29213 和ATCC 25923，最低抑菌浓度比纯色素低2～5 倍.紫色杆菌素/聚己内酯/壳聚糖纳米粒子对S.aureus的最小抑菌浓度是25 μM，比单纯色素的最小抑菌浓度要低.如今许多细菌具有耐药性，而紫色杆菌素与其他常用抗生素组合用于抑制致病菌，具有协同效应，抑菌作用更好.紫色杆菌素—庆大霉素和紫色杆菌素—头孢羟氨苄组合使用，对S.aureus 的MIC是1.0 μg/mL，低于单纯色素的MIC（5.7 μg/mL）.紫色杆菌素和大环内酯物、氨基糖苷类抗生素组合使用的FICI低于0.5，表现出协同作用.紫色杆菌素与盘尼西林组合使用，对盘尼西林耐药性的S.aureus 具有协同抑制作用，且二者组合使用的MIC比单独使用的MIC要低得多.此外，紫色杆菌素还具有杀真菌特性，可以抑制植物真菌病原菌，如可导致桑树根腐病的Rosellinia necatrix.

3.2 抗肿瘤

早期研究指出紫色杆菌素表现出抗肿瘤活性，可以抑制恶性细胞增殖，许多学者都在研究紫色杆菌素作为抗肿瘤药物的潜能及其作用的机制[14].体外试验发现紫色杆菌素可以抑制MOLT-4 白血病细胞、NCIH460非小细胞性肺癌、KM12结肠癌细胞，GI50在0.03～0.06 μM范围内，而对多种淋巴瘤的抑制GI50为0.12～0.32 μM.Melo等[15]评估紫色杆菌素对V79成纤维细胞的细胞毒性时，发现紫色杆菌素对V79细胞具有高毒性，IC50为5～12 μM，且紫色杆菌素引发了V79细胞凋亡而不是坏死，细胞形态发生染色质凝聚和核酸量减少.Saraiva 等[14]报道紫色杆菌素可抑制葡萄膜黑色素瘤细胞92.1 和OCM-1，其IC50分别是2.78 μM 和3.69 μM.紫色杆菌素对白血病细胞有较好的抑制作用.Gimenez等[16]发现紫色杆菌素对V79细胞的IC50是5 μM，对白血病细胞HL60的IC50是0.8 μM.同时，发现紫色杆菌素/β-环糊精复合物增强了对HL60细胞的毒性效应，但对V79细胞毒性下降.当紫色杆菌素与β-环糊精以1：2的比例形成络合物时，可增加紫色杆菌素的溶解性，但对V79细胞的毒性低于相同浓度（1.2 μM）的纯色素.通过研究紫色杆菌素诱使肿瘤细胞死亡的机制，发现紫色杆菌素对不同的肿瘤细胞会有不同的分子机制.紫色杆菌素通过介导活性氧簇物（ROS）的产生，引起人类结肠癌细胞Caco-2的凋亡，但在HT29细胞中不能增加ROS的产生，表明紫色杆菌素存在细胞类型特异性分子机制，同时也指出氧化压力在紫色杆菌素的细胞毒性中起一定作用.Bromberg等[13]研究了紫色杆菌素对埃利希腹水瘤（EAT）的抑制作用，EAT细胞对紫色杆菌素的敏感度（IC50＝5.0 μM）是正常人外周血淋巴细胞的2倍.

3.3 抗病毒

May等[17]发现紫色杆菌素可抑制侵染HeLa细胞的单纯性疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）和脊髓灰质炎病毒.当紫色杆菌素混合物（含质量浓度为10%的脱氧紫色杆菌素）的浓度为0.25 μg/mL和0.063 μg/mL时，可分别抑制62%的单纯性疱疹病毒和56%的脊髓灰质炎病毒；同时，还指出紫色杆菌素混合物具有更好的抗病毒活性.Andrighetti-Frohner等[18]研究指出紫色杆菌素对FRhK-4，Vero，MA104和Hep-2细胞的细胞毒性CC50在2.07～2.70 μM 的范围.浓度在0.078～2.5 μM 的紫色杆菌素对阿昔洛韦耐药性的HSV-1 病毒29-R、甲肝病毒（HN175 和HAF-203）和腺病毒5 型没有细胞病变效应或抗病毒活性，但浓度为0.312～1.250μM的紫色杆菌素对KOS和ATCC/VR-733 HSV病毒、脊髓灰质炎病毒2型、猴轮状病毒SA11有弱的抑制病毒复制作用.初步研究还显示，紫色杆菌素脂质体形式可增强对HSV-1的抵抗活性.

3.4 抗氧化

紫色杆菌素具有抗氧化活性，这可能与它的生物学功能有关.Rettori等[19]得到了Chromobacerium violaceum 在10%和50%溶氧条件下的生长曲线，发现紫色杆菌素产量在细菌对数生长期有一个最高值，而且50%溶氧条件下的产量是10%溶氧条件下的3倍.当有过氧化氢酶或抗坏血酸存在时，紫色杆菌素的生产会延迟2 h.这些结果表明，C.violaceum 生产紫色杆菌素作为抗氧化剂，以保护自身不受活性氧的氧化性损伤.Duran等[12]发现紫色杆菌素/β-环糊精可以防止胃溃疡发生，对HCl-乙醇引起的胃溃疡抑制率达85%，推测紫色杆菌素的抗氧化活性可能增强了胃粘膜的防御机制，从而产生对胃溃疡的抑制效应.当紫色杆菌素和β-环糊精形成1：2的络合物时，可增强紫色杆菌素的抗氧化活性，保护老鼠肝细胞免受过氧化损伤.质量浓度为100 μM的紫色杆菌素和紫色杆菌素/β-环糊精络合物，对红细胞脂质过氧化的抑制率分别为50%和80%，当质量浓度为500 μM时，络合物可完全抑制脂质过氧化，而纯紫色杆菌素只有65%的抑制率.

4 结语

由于紫色杆菌素具有多种生物活性功能，因而在许多方面具有应用潜力，如在医药、染料、农药等行业的应用有待开发.目前，紫色杆菌素作为药物使用，关于其对正常细胞的毒性及可能出现的毒副作用方面的研究报道尚不多见，需要通过药理实验研究如何提高其生物活性，降低其细胞的毒性及副作用，使之发挥和其他药物的协同疗效.虽然紫色杆菌素的生物活性给予它很好的应用前景，但由于微生物生产紫色杆菌素的产量仍然比较低，有关发酵生产工艺的研究较少；因此，我们应加快紫色杆菌素的基因工程构建、高产菌株筛选及生产工艺的深入研究.此外，目前大多数报道都是关于紫色杆菌素的研究，关于其副产物脱氧紫色杆菌素生物活性的研究则较少，已有报道指出脱氧紫色杆菌素可能在抗肿瘤活性中也能起一定作用.由此可见，对脱氧紫色杆菌素生物功能及特性的研究也非常有必要.

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