桔梗高效离体再生体系的建立

张江丽 李培飞 苑雄雄 刘雪 周凌霞 杨烁烁

摘要：分析了消毒时间、6-BA浓度、外植体放置方式、叶龄对桔梗[Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.] 丛生芽形成过程的影响。结果表明，0.1%升汞消毒5 min的桔梗种子成活率最高；诱导桔梗丛生芽的最适培养基为MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA；叶片是最佳外植体；叶片近轴面贴近培养基时，出芽快；叶龄越短，脱分化所需时间越短。

关键词：桔梗[Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC] ；高效；再生体系

中图分类号：Q949.783.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）21-5436-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.060

Establishment of A Highly Efficient in Vitro Regeneration System for

Platycodon grandiflorum （Jacq.）A.DC.

ZHANG Jiang-li1，2，LI Pei-fei1，YUAN Xiong-xiong1，LIU Xue1，ZHOU Ling-xia1，YANG Shuo-shuo1

（1. School of Life Science， Langfang Teachers University，Langfang 065000， Hebei，China；

2. Edible and Medicinal Fungi Research and Development Center of Hebei Universities， Langfang 065000， Hebei， China）

Abstract：The effects of disinfection time，6-BA level，explant orientation and leaf ages on formation of multiple shoots of Platycodon grandiflorum （Jacq.）A.DC. were examined. The results showed that the survival rate of seeds was highest under 0.1% HgCl2 disinfection for 5 minutes. The best medium for multiple shoots induction was MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA and the best explant was leaf. When it contact the medium， the adaxial surface of leaf explant was better for shoot induction. The younger a leaf age was， the sooner the leaf dedifferentiated.

Key words：Platycodon grandiflorum （Jacq.）A.DC.；highly efficient；regeneration system

桔梗[Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.] 为桔梗科、桔梗属多年生双子叶草本植物，其根为著名的中药材，具有宣肺、祛痰、散寒、镇咳、消肿、排脓等功效[1]，其嫩苗、根均可食用，在中国东北地区以及日、韩、朝等东亚国家是一种常见蔬菜，具有很高的营养价值。桔梗是一种药、食、赏兼用植物，在中国分布广泛，产地有安徽、河南、湖北、辽宁、吉林、河北、内蒙古等地。

桔梗的市场需求量很大，除野生资源外，人工栽培是满足市场需要的一个重要保障。由于桔梗种子发芽率较低，制约了其生产和发展。近年来，研究者对桔梗的组织培养进行了研究[2-6]。本试验利用生物技术对桔梗细胞全能性的实现进行了初探，考察了外植体种类、年龄、放置方式、消毒方式等因素对桔梗离体培养的影响，获得了桔梗高效离体再生体系，为桔梗的组织培养提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

桔梗种子：市售一年新种，购于河北省安国市胜利秧苗种子供应站。

外植体：萌发15、20、25、30、35、40 d的桔梗无菌苗叶片和茎段。

诱导培养基：以MS培养基为基本培养基，附加植物生长调节物质、3%蔗糖、0.7%琼脂，pH调至5.8，121 ℃高温灭菌20 min。①MS + 0.5 mg/L NAA；②MS + 0.5 mg/L NAA +0.1 mg/L 6-BA；③MS +0.5 mg/L NAA +0.5 mg/L 6-BA；④MS + 0.5 mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA。

1.2 丛生芽的诱导

1.2.1 无菌苗的获得 挑选色泽鲜亮、粒大、饱满、种皮无破损、无霉病斑的桔梗种子，置于超净台上，用75%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗3次。再用0.1%升汞分别消毒3、4、5、6、7 min，无菌水冲洗4～5次，接种于MS基本培养基中，（25±1） ℃暗培养3 d。待种子萌发后，转入温度（25±1）℃、光强3 000 lx、光照时间16 h/d的条件下培养，获得无菌苗[7]。

1.2.2 外植体的选择 分别取萌发15、20、25、30、35、40 d的无菌苗叶片和茎段为外植体，幼叶切成0.5 cm×0.5 cm小块，茎段剪成长约1 cm的小段。

1.2.3 诱导培养 将外植体接种到诱导培养基中，（25±1） ℃暗培养3 d，转入（25±1） ℃、3 000 lx、16 h/d条件下培养。

1.3 数据统计

出芽率=诱导出丛生芽的外植体块数/接种的外植体块数×100%

2 结果与分析

2.1 形态学观察

从图1可以看出，桔梗茎段接种后第5～6天，切口处开始膨大，颜色逐渐变绿，10 d后开始长出芽点，逐渐变成幼芽，12～21 d时幼芽丛生化程度高，高度可达2～3 cm，呈嫩黄绿色，30 d观察时，芽高可达4～6 cm。桔梗叶片接种后第5～10天，逐渐膨大卷曲，边缘下翘或中部隆起，叶色变浅。培养10～16 d，开始形成幼芽，颜色浅绿，继续培养，绿色逐渐加深。25 d后，芽颜色变为深绿色且逐渐形成丛生芽。培养16 d时，有的丛生芽基部开始长出气生根，随6-BA浓度的增加，幼芽数量逐渐增多，但气生根量逐渐减少。

2.2 不同消毒时间对桔梗种子污染率和发芽时间的影响

由表1可见，桔梗种子用70%乙醇消毒30 s后，分别用0.1%升汞消毒3、4、5、6、7 min，培养18 d后，种子开始萌发。随着消毒时间的增加污染率逐渐下降，但出芽时间逐渐延长。结果表明，消毒5 min的桔梗种子污染率较低且出芽快。因此，对于桔梗种子，经70%乙醇浸洗30 s后，再用0.1%升汞消毒5 min效果最好。

2.3 不同浓度6-BA对桔梗茎段离体培养的影响

培养30 d时进行观察，不同浓度6-BA诱导桔梗茎段产生丛生芽详见表2。结果表明，当6-BA浓度不同时，以桔梗茎段为外植体诱导的丛生芽形态和长势差异明显。

当培养基中6-BA浓度不同时，对桔梗茎段的诱导率明显不同。①号培养基启动较快，能形成少量从生芽，大部分形成愈伤。②号培养基不能形成丛生芽也不能很好地形成愈伤，实际观察中出愈较慢，大约需要21 d。①号、②号培养基均不适宜桔梗茎段丛生芽的诱导。③号培养基启动较快，虽有丛生芽产生，但长势一般，部分也形成愈伤。④号培养基在6 d时茎段切口处有所膨大，颜色逐渐变绿，10 d左右时长出幼小叶片，逐渐变成幼芽；20 d时幼芽充满整个培养基，高度可达2～3 cm，呈嫩黄绿色；30 d观察时，芽高可达4～6 cm。整个培养过程中长势很好，基本全部形成丛生芽，说明添加了1.0 mg/L 6-BA的培养基适宜桔梗茎段丛生芽的诱导。

2.4 不同浓度6-BA对桔梗叶片离体培养的影响

由表3可知，在4种培养基上，以桔梗叶片为外植体的诱导率均为100%。随着6-BA浓度的增加，丛生芽的生根情况和丛生化程度不同。①号培养基启动偏慢，开始幼叶基部长出小芽，小芽数量逐渐增多并形成丛生芽，在此过程有气生根生成；16 d时已经生成了大量的气生根且贯穿在整个培养基；25 d时，幼叶直接长成了小植株；②号培养基也是先在基部生成小芽并生根，但根的数量相对①号培养基少，气生根贯穿于整个培养基中，但②号培养基在一定程度上丛生化，有许多丛生芽形成；③号培养基启动相对较快，6 d时长出小芽，继续培养，迅速生成大量丛生芽，在出芽的过程中有少量气生根生成，15 d时生成大量丛生芽，芽高可达2～4 cm，长势良好；④号培养基启动最快，5 d时出芽，10 d时丛生化程度较高，但④号培养基没有气生根形成，15 d后观察，芽高可达4～6 cm。整个培养过程中长势良好，全部生成丛生芽，适宜桔梗幼叶丛生芽的诱导。①～④培养基诱导率均为100%，其中④培养基为诱导桔梗丛生芽的最佳培养基。

2.5 外植体放置方式对丛生芽诱导的影响

以桔梗幼叶做为外植体，分别以近轴面、远轴面朝下接种在④号培养基中，结果（表4）表明，外植体在培养基中的放置方式对诱导时间有影响，但对诱导率无影响。叶片无论近轴面还是远轴面贴近培养基，诱导率都相同，达到100%，但近轴面贴近培养基出芽更快。

2.6 不同日龄桔梗无菌苗叶片对脱分化时间的影响

选取萌发15、20、25、30、35、40 d的桔梗无菌苗叶片分别接种到④号培养基，观察其脱分化所需要的时间，结果（表5）表明，叶龄越短，脱分化所需时间越短。

3 讨论

细胞分裂素和生长素是植物组织培养中不可缺少的植物生长调节物质，左艇等[8]的研究表明6-BA为诱导丛生芽的主要影响因素，由本试验可以看出，6-BA的浓度对桔梗丛生芽的诱导率影响较大，在NAA浓度为0.5 mg/L时，6-BA在0～1.0 mg/L范围内时，随着6-BA浓度的升高桔梗丛生芽诱导率先下降后上升，当6-BA浓度为0.1 mg/L时出芽率最低，但随着6-BA浓度的进一步升高，桔梗的出芽率逐渐上升。在对桔梗丛生芽诱导的分析中可以看出，NAA的用量对丛生芽诱导率也有一定影响。当 NAA浓度为0.5 mg/L，6-BA浓度为1.0 mg/L时，其诱导效果最好，这与左艇等[8]的报道一致。

本试验结果表明，桔梗叶片近轴面贴近培养基诱导丛生芽时，出芽快，这可能是因为叶片近轴面气孔多，容易吸收培养基中的营养物质和植物激素，所以出芽快。但近轴面、远轴面贴近培养基的出芽率相同，均为100%，说明叶片放置方式只影响桔梗的脱分化速度，与杨莉[9]对金柑的研究略有不同。

桔梗叶龄越短，脱分化所需时间越短，这可能是因为叶片日龄短，自身分化程度低，更易于脱分化，再分化成芽或植株，与林超[10]对白木香组织培养的研究报道一致。

桔梗植株表面密生绒毛，在自然条件下生长很容易吸附杂菌，有些杂菌甚至能够侵入组织内部，再对其消毒也很难除去这些杂菌，因此组织培养中外植体极易污染。本试验采用了无菌播种的方法先获得无菌苗，再进行丛生芽的诱导，这样就避免了自然条件下杂菌对植株的影响，降低了污染的发生，大大提高了试验效率。

4 小结

1）70%乙醇30 s、0.1%升汞消毒5 min的桔梗种子，污染率最低且出芽最快。

2）桔梗的叶片和茎段在丛生芽诱导过程中，叶片是最佳外植体。

3）诱导桔梗丛生芽形成的最适培养基为：MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA。

4）叶片近轴面朝下贴近培养基诱导丛生芽时，出芽快，但对诱导率无影响。

5）叶龄越短，脱分化所需时间越短。

参考文献：

[1] 刘德军，马维希.桔梗[M].北京：中国中医药出版社，2001.

[2] 吴京姬，吴基日，严一字，等.提高桔梗组织培养效率的研究[J].安徽农业科学，2007，35（12）：3565，3572.

[3] 舒 娈，高山林.桔梗的组织培养[J].植物资源与环境学报，2001，10（3）：63-64.

[4] 杨耀文，钱子刚，李保军，等.药用植物桔梗的组织培养初步研究[J].云南中医学院学报，2002，25（4）：9-10.

[5] 张风生，姜 淼，李建红，等.桔梗的组织培养及快速繁殖[J].2007（1）：165.

[6] 向邓云.桔梗愈伤组织诱导及不定芽形成研究[J].重庆师范学院学报（自然科学版），2001，23（4）：866-869.

[7] 李铁军，张孝卫，王 兵，等.桔梗无菌苗的诱导与快速繁殖[J].中国现代中药，2007，9（3）：39，48.

[8] 左 艇.桔梗离体培养和快速繁殖方法研究[J].河南中医学院学报，2008，23（138）：40-41.

[9] 杨 莉.金柑遗传转化体系的建立与应用[D].杭州：浙江大学，2006.

[10] 林 超.白木香组织培养及多倍体诱导研究[D].广州：广州中医药大学，2013.