Box—Behnken设计优化蒙古口蘑多糖的超声提取工艺

王治宝 王刚 王阿娇 康倩倩 王金

摘要：利用响应面分析法对蒙古口蘑（Tricholoma mongolicum）多糖的超声辅助提取工艺进行优化。在单因素试验的基础上，选取提取时间、提取温度和超声功率进行3因素3水平的Box-Behnken中心组合研究，应用Design-Expert软件对试验结果进行分析。结果表明，建立的二次方程模型拟合度良好（R2为0.988 4），各因素对多糖得率的影响顺序依次为超声功率、超声时间、提取温度。最佳提取条件为提取温度45 ℃，超声时间21 min，超声功率290 W。在此条件下，蒙古口蘑多糖得率为19.53%，与预测值（19.76%）高度符合。

关键词：蒙古口蘑（Tricholoma mongolicum）；多糖；超声提取；Box-Behnken 设计

中图分类号：S646.1+9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）21-5391-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.048

Optimization of Ultrasound-assisted Extraction of Polysaccharides from

Tricholoma mongolicum Using Box-Behnken Design

WANG Zhi-Bao1，WANG Gang2，WANG A-jiao3，KANG Qian-qian1，WANG Jin1

（1.Department of Pharmacy， Hebei North University， Zhangjiakou 075000，Hebei， China； 2.Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co. Ltd， Shijiazhuang 050035， China； 3.Department of Pharmacy， the Peoples Hospital of Langfang City， Langfang 065000， Hebei， China）

Abstract： The ultrasound-assisted extraction of crude polysaccharides from Tricholoma mongolicum with water was investigated using response surface methodology. On the basis of single factor test，three variables， including extraction temperature， extraction time and ultrasonic power were studied and Box-Behnken design was employed to optimize the extraction parameters. A multiple regression analysis was used to fit the second-order polynomial equation to the experimental data with a high correlation coefficient （0.988 4）. According to the significance of regression coefficients of quadratic model and gradient of slope in plots， ultrasonic power was the most remarkable factor affecting the TMIPs yield， followed by extraction time and extraction temperature. The results showed that the optimal conditions as follows： extraction temperature 45 ℃，extraction time 21 min and ultrasonic powe 290 W. Under the optimum conditions， the yield of experiment was 19.53%， which is consistent with the predicted value by RSM model（19.76%）.

Key words： Tricholoma mongolicum；polysaccharides； ultrasound-assisted extraction； Box-Behnken design

蒙古口蘑（Tricholoma mongolicum），又称白蘑、口蘑，主要分布于中国河北、内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁等地[1，2]。蒙古口蘑不仅味美独特，还可入药，其性平、味甘，有宣肠益气、散热解表的功效。现代药理研究表明，植物多糖具有抗疲劳、调节血脂、降血糖、免疫调节、防癌抗癌等作用[3-6]，因此从天然产物及菌类中开发具有生物活性的多糖成分倍受关注。本试验采用超声辅助技术提取蒙古口蘑多糖，并采用Box-Behnken设计对其提取工艺进行优化，为进一步开发蒙古口蘑奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蒙古口蘑购自于当地超市，粉碎，过40目筛备用。D-葡萄糖购于上海阿达玛斯试剂有限公司，浓硫酸、苯酚、乙醇均为分析纯，水为蒸馏水。

KQ-400KDE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.2 多糖的测定

精确称取标准品葡萄糖200 mg，置于50 mL量瓶中，加水定容至刻度，即得到对照品溶液。

精确称取5.0 g口蘑粉末，加水100 mL，超声提取，提取液离心（3 000 r/min，5 min），取上清液10 mL定容至25 mL量瓶中，得到供试品溶液[7]。

1.3 线性关系考察

精确吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于25 mL具塞比色管中，分别加入蒸馏水补足至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，浓硫酸5.0 mL，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置10 min，沸水浴5 min，冰水浴冷却5 min，摇匀，同时以未加对照品的比色液为空白，于490 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归分析。

1.4 单因素试验

1.4.1 提取温度对多糖得率的影响 精确称取蒙古口蘑10 g，每克材料加入蒸馏水20 mL，分别在30、40、50、60、70 ℃下进行超声分析（超声功率为200 W）提取蒙古口蘑多糖30 min，分析不同提取温度对蒙古口蘑多糖得率的影响。

1.4.2 超声时间对多糖得率的影响 精确称取蒙古口蘑10 g，每克材料加入蒸馏水20 mL，在超声功率为200 W，提取温度50 ℃条件下，对蒙古口蘑分别提取10、15、20、25、30、35 min，分析不同超声时间对蒙古口蘑多糖得率的影响。

1.4.3 超声功率对多糖得率的影响 采用料液比（1∶20，g∶mL），分别以200、240、280、320、360 W的超声功率于50 ℃超声提取20 min，分析不同超声功率对蒙古口蘑多糖得率的影响。

1.5 Box-Behnken设计及模型拟合

根据单因素试验结果，影响多糖得率的因素主要有提取温度（X1）、超声时间（X2）和超声功率（X3）。以这3个因素为主要影响因素，以蒙古口蘑多糖为评价指标进行试验设计，试验因素及水平见表1。采用Design-Expert程序对Box-Behnken中心组合试验结果进行回归分析。

1.6 验证试验

为了验证模型与试验结果是否相符，进行3组平行试验对其进行验证。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归分析，得到的回归方程为y=0.002 3x+0.040 1 （r=0.999 6），表明葡萄糖在32.0～160.0 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取温度对多糖得率的影响 由图1a可知，随着提取温度的升高，蒙古口蘑多糖得率明显升高；但当提取温度高于50 ℃时，多糖得率有所下降。因此，超声提取蒙古口蘑，适宜的提取温度为50 ℃。

2.2.2 超声时间对多糖得率的影响 由图1b可知，在初始阶段，随着提取时间的延长，蒙古口蘑多糖得率迅速升高，在提取20 min时出现最大值，之后略有下降。主要原因可能是超声效应破坏细胞壁，有利于多糖的释放，但是过长的超声时间可能会破坏多糖的结构。因此，适宜的超声时间为20 min。

2.2.3 超声功率对多糖得率的影响 由图1c可知，蒙古口蘑多糖得率随着超声功率的增大呈上升趋势，当超声功率为280 W时达到最大值。因此，适宜的超声功率为280 W。

2.3 Box-Behnken试验结果

根据单因素试验结果，影响蒙古口蘑多糖得率的因素主要有提取温度（X1）、超声时间（X2）和超声功率（X3）。以这3个因素为主要影响因素，以蒙古口蘑多糖得率为评价指标进行试验设计，试验结果如表2所示。回归模型方差分析结果如表3所示。

采用Design-Expert程序对所得数据进行分析，经拟合得到回归方程如下：

Y=-272.593+0.933×X1+7.384×X2+1.329×X2-0.027×X1X2+0.000 69×X1X2+0.006 9×X2X2-0.006 2×X■■-0.019 2×X■■-0.002 6×X■■

由表3方差分析结果可知，该回归模型P<0.001，方程模型显著，失拟项P=0.082 7>0.05，不显著，说明试验方法准确可靠。回归模型的总决定系数（R2）和调整决定系数（Adj R2）均大于0.95，说明方程拟合程度较好，试验误差小，该回归方程可用于超声提取蒙古口蘑多糖的分析和预测。在所选各因素的范围内，影响多糖得率的顺序为超声功率、超声时间、提取温度。

2.4 响应面优化预测及验证试验

根据拟合得到的二次多项式方程，制作蒙古口蘑多糖得率的效应曲面（图2）。由图2可知，超声功率（X3）和超声时间（X2）对多糖得率的线性效应显著，X■■和X■■对蒙古口蘑多糖得率的曲面效应极显著，X1X2和X2X3交互作用显著。对回归方程求一阶导数，当响应值（多糖得率）有最大值时，各因素分别为提取温度44.78 ℃， 超声时间21.25 min和超声功率290.37 W，在此条件下蒙古口蘑多糖得率的预测值为19.76%。

2.5 验证试验

为了验证模型与试验结果是否相符，进行3组平行试验对其进行验证，考虑到实际操作的可行性，验证试验中采用提取温度45 ℃，超声时间21 min和超声功率 290 W。结果表明，蒙古口蘑多糖平均得率为19.53%，与模型预测值非常接近，说明基于响应面法所得的优化工艺参数比较可靠，具有一定的实用价值。

3 小结

响应面优化法通过考察影响因素的响应面，从效应面上选择合适的响应区，确定自变量的取值范围[8，9]。此方法利用非线性数学模型拟合回归方程，在中心点重复试验以减少试验误差，提高准确度，具有试验次数少、预测性好等优点，广泛应用于中药提取工艺优化[10，11]。本试验通过单因素试验分析，选用3因素3水平Box-Behnken试验设计，建立各因素与蒙古口蘑多糖得率的回归模型，绘制三维效应曲面图和二维等高线图，预测了最佳提取工艺条件，验证试验表明实测值与预测值较为接近，说明该模型可用。

参考文献：

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