正交试验法优化陈皮中橘皮素和川陈皮素的提取工艺

张相飞 李凌绪

摘要：橘皮素和川陈皮素是陈皮多甲氧基黄酮的重要活性成分，以HPLC法测定陈皮提取物中橘皮素和川陈皮素的含量，优选了提取溶剂，设计正交试验考察了提取温度、提取时间、溶剂添加量和提取次数对提取工艺的影响，确定了最佳提取工艺。结果表明，石油醚是同时提取橘皮素和川陈皮素的适宜溶剂，正交试验所得的最佳提取工艺为加入6倍量石油醚，80 ℃提取4次，每次3 h，所获得的提取工艺合理、稳定、可靠。

关键词：陈皮；橘皮素；川陈皮素；正交试验；工艺

中图分类号：R282.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）21-5364-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.041

Optimize Extraction Technology for Tangeretin and

Nobiletin Using Orthogonal Design Method

ZHANG Xiang-feia， LI Ling-xub

（Qingdao Agricultral University， a. College of Chemistry and Pharmaceutical Science；b. College of Agronomy and Plant Protection，

Qingdao 266109， Shandong， China）

Abstract： Tangeretin and nobiletin were important polymethoxyflavones in tangerine peel. The content of tangeretin and nobiletin were measured by HPLC methods. The extracting solvents were selected. The influence of extracting temperature， extracting time， the menstruum dosage， extracting times were investigated using orthogonal design method. The results showed that petroleum ether was the best extracting solvent. The optimal conditions for the extraction technology were as follows： extracting for four times， each time for 3 h at 80 ℃， with 6 times the amount of petroleum ether. This extraction technology is reasonable， stable and feasible.

Key words： tangerine peel； tangeretin； nobiletin； orthogonal design； extraction technology

陈皮是我国传统中药，富含黄酮等多种活性成分，其来源为芸香科柑橘属植物柑橘的果皮。多甲氧基黄酮（Polymethoxylated Flavones，PMFs）是芸香科植物特有的活性成分，因其良好的抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等活性受到国内外学者的关注[1-3]。同时PMFs也是柑橘果实贮存期重要的抗病物质，在果实采摘后可抵抗柑橘青霉菌（Penicillium digitatum）[1，4]、柑橘褐腐疫霉病菌（Phytophthora citrophthora）[5，6]等病菌的侵染。橘皮素和川陈皮素是PMFs的重要组成部分，对胃癌、肺癌等肿瘤细胞有良好的抑制活性[7-10]，同时对胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）[11]、苹果腐烂病菌（Valsa mali）均有很强的抑菌活性。

我国是柑橘生产大国，每年产生的橘皮高达300万t[12]，绝大部分被丢弃浪费。如能利用废弃的橘皮资源，提取其中的橘皮素和川陈皮素等活性成分，将其开发为药物、保健品、植物源农药等高附加值商品，将极大地提高橘皮的商业价值，具有重要的现实意义。目前，已有关于橘皮素或川陈皮素提取方法的报道[13，14]，李成平等[15]报道了微波法提取橘皮中橘皮素和川陈皮素的工艺，但仅使用75%乙醇作为提取溶剂，并未对提取溶剂进行筛选。75%乙醇对橘皮素的溶解性较低且易溶出蛋白质、多糖等水溶性成分，给后续纯化工艺造成干扰。本试验采用浸提法提取橘皮中的橘皮素和川陈皮素，设计单因素试验对提取溶剂进行筛选，并设计L16（45）正交试验对其提取工艺进行优化，最终确定最佳提取工艺，为工业上提取橘皮素和川陈皮素提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器、材料与试剂

LC-10高效液相色谱仪为日本岛津公司产品。试验所用橘皮为中药材陈皮，购自青岛市城阳区富康大药房，产地为浙江黄岩，在室内阴干，粉碎备用。橘皮素对照品和川陈皮素对照品购自北京北研馨绿生物技术有限公司。HPLC分析采用乙腈（天津市申通化工有限公司）和甲醇（天津市巴斯夫化工有限公司）二者均为色谱纯，水为超纯水。

1.2 橘皮素和川陈皮素的测定

1.2.1 色谱条件 色谱柱为Bondapak C18柱（300 mm×3.9 mm，5 μm），流动相为乙腈∶甲醇∶水（50∶20∶30），流速1.0 mL/min，UV检测器，检测波长255 nm，进样量20 μL，柱温25 ℃。在此条件下，橘皮素和川陈皮素的保留时间分别为8.7 min和6.9 min（图1）。

1.2.2 对照品溶液的制备 称取川陈皮素对照品和橘皮素对照品各50.00 mg，分别置于500 mL容量瓶中，以10 mL甲醇溶解并用流动相定容，摇匀，冷却至室温，用0.2 μm滤膜过滤即为储备液，备用。

1.2.3 供试样品的制备 精确称取陈皮粉末5 g，置于圆底烧瓶中，加入适量溶剂，热回流提取。提取液经抽滤后蒸干用10 mL甲醇溶解定容，取1 mL置于25 mL容量瓶中用流动相定容，摇匀后用0.2 μm微孔滤膜过滤，备用。

1.2.4 绘制标准曲线 分别精确量取上述储备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL容量瓶中，用流动相定容，摇匀。按照“1.2.1”的色谱条件分别进样，记录色谱图，采用面积归一化法测定峰面积。以每个对照品的质量分数为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。

1.2.5 精密度试验 取质量分数为2 μg/mL的橘皮素和川陈皮素对照品，按“1.2.1”的色谱条件进行5次平行测定，计算平均峰面积的RSD值，结果表明橘皮素的RSD值为0.56%，川陈皮素为0.68%。

1.2.6 稳定性试验 取相同供试品溶液，每隔2 h进样1次，测定6次，记录色谱图，计算橘皮素RSD为0.89%，川陈皮素RSD为1.6%，表明供试样品在12 h内稳定。

1.2.7 分析方法的准确度 称取6份已知准确含量的橘皮素和川陈皮素试样，分别加入一定量的标准品，然后按照上述方法和操作条件进行重复测定，计算橘皮素和川陈皮素的平均回收率分别为98.3%、101.3%，表明该方法准确度较高。

1.2.8 样品测定 取样品适量，按“1.2.1”的色谱条件进样分析，计算橘皮素和川陈皮素的量，得到陈皮提取物的HPLC图谱（图2）。

1.3 提取溶剂的选择

分别称取陈皮粉末5份，每份5 g，依次加入9倍体积的石油醚（60～90 ℃）、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、无水乙醇，60 ℃提取2 h，按“1.2.3”的方法制备样品溶液，并按“1.2.1”的色谱条件分析橘皮素和川陈皮素的含量。

1.4 提取条件的选择

根据“1.3”的试验结果，确定石油醚为最佳提取溶剂。以提取温度、料液比、提取时间、提取次数为影响因素，每因素设定4个水平，进行正交试验，选用L16（45）正交试验（表1），以橘皮素和川陈皮素的提取量为评价指标，计算R值并进行方差分析。

1.5 验证试验

准确称取陈皮粉末3份，每份5 g，按最佳提取工艺条件进行提取，按“1.2.1”的方法进行橘皮素和川陈皮素的含量分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

以对照品的质量分数为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。橘皮素的标准曲线方程为Y=29.107 7X+0.268 9，R2=0.999 7，川陈皮素的标准曲线方程为Y=56.570 3X+0.350 0，R2= 0.999 9。结果表明，橘皮素、川陈皮素在1～10 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.2 提取溶剂的选择

不同溶剂对橘皮素和川陈皮素的提取结果见表2。由表2可知，除石油醚之外，橘皮素在其他溶剂中的溶解度非常低，因此，综合考虑选取石油醚为提取溶剂。

2.3 正交试验结果

正交试验结果见表3，由直观分析可知，各因素对橘皮素和川陈皮素提取效果的影响顺序均为D、A、B、C，橘皮素的最优提取工艺为A4B3C1D4，川陈皮素的最优提取工艺为A4B3C4D4。由方差分析结果（表4）可知，提取温度、提取次数对橘皮素和川陈皮素的提取率均有显著影响，而提取时间、料液比对橘皮素和川陈皮素的提取均无显著影响。为了节省溶剂，选择料液比为1∶6。综上所述，确定最佳提取工艺为A4B3C1D4，即加入6倍量的石油醚，80 ℃提取4次，每次3 h。

2.4 验证试验结果

验证试验结果表明，采用正交试验设计得到的最佳提取工艺，提取的橘皮素分别为1.026、1.018、1.009 mg/5 g药材，川陈皮素分别为1.758、1.721、1.737 mg/5 g药材，表明优化的提取工艺稳定、可靠，可兼顾橘皮素和川陈皮素的提取效果。

3 讨论

橘皮素和川陈皮素是陈皮多甲氧基黄酮的重要组分，具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗菌等多种活性，本试验以橘皮素和川陈皮素两个成分为指标，考察了陈皮的提取工艺，具有一定的现实价值。

本试验以乙腈-甲醇-水为流动相进行等度洗脱，条件简单易行，相比甲醇-水或乙腈-水的洗脱系统能显著缩短分析时间[14，15]。本试验首先对提取溶剂进行了筛选，选择非极性的石油醚作为提取溶剂，可避免浸出蛋白质、多糖等极性成分，使后续分析及纯化步骤更容易处理。

参考文献：

[1] ORTU？譙O A，B？魣IDEZ A，G？魷MEZ P，et al. Citrus paradisi and Citrus sinensis flavonoids：Their influence in the defence mechanism against Penicillium digitatum[J]. Food Chemistry，2006， 98（2）：351-358.

[2] 陈 震，康 娜，郝东宁，等.多甲氧基黄酮对人胶质母细胞瘤细胞系生物学特性的影响[J].现代生物医学进展，2013，13（33）：6471-6474.

[3] 王 磊，苏学素，付陈梅，等.柑橘中多甲氧基黄酮生物活性及应用研究进展[J].食品科学，2009，30（7）：285-290.

[4] ARCAS M C，BOT？魱A J M，ORTU？譙O A M，et al.UV irradiation alters the levels of flavonoids involved in the defence mechanism of Citrus aurantium fruits against Penicillium digitatum[J].European Journal of Plant Pathology，2000，106（7）：617-622.

[5] DEL R？魱O J A， GOMEZ P， BAIDEZ A G， et al. Changes in the levels of polymethoxyflavones and flavanones as part of the defense mechanism of Citrus sinensis （cv. Valencia Late） fruits against Phytophthora citrophthora[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2004， 52（7）： 1913-1917.

[6] DEL R？魱O J A，ARCAS M C， BENAVENTE-GARC？魱A O，et al. Citrus polymethoxylated flavones can confer resistance against Phytophthora citrophthora，Penicillium digitatum，and Geotrichum species[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998， 46（10）：4423-4428.

[7] 鲁 岚，董 杨，施建蓉，等.橘红素增强5-氟尿嘧啶抑制人胃癌AGS细胞增殖的作用及其机制研究[J].中国药理学通报，2011，27（6）：760-763.

[8] 董 杨，季 光，施建蓉，等.橘红素上调Cyclin B1和抑制ERK磷酸化诱导人胃癌AGS细胞周期阻滞[J].中国药理学通报，2012，28（6）：823-827.

[9] 王光凤，王小晨，肖 璘，等.柑橘黄酮川陈皮素的抗肿瘤作用研究[J].中草药，2007，38（11）：1694-1697.

[10] 管晓琳，罗 刚，朱 玲，等.川陈皮素诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡的研究[J].中国药科大学学报，2006，37（5）：443-446.

[11] ALMADA-RUIZ E，MART？魱NEZ-T？魪LLEZ M ？魣，HERN？魣NDEZ-？魣LAMOS M M，et al.Fungicidal potential of methoxylated flavones from citrus for in vitro control of Colletotrichum gloeosporioides，causal agent of anthracnose disease in tropical fruits[J].Pest Management Science，2003，59（11）：1245-1249.

[12] 李凌绪，魏 艳，杜春华，等.橘皮提取物对7种农业植物病原真菌的抑菌活性研究[J].安徽农业科学，2008，36（30）：13242-13243.

[13] 于宏伟，韩卫荣，周二鹏，等.橘皮素的提取及应用研究进展[J].江苏农业科学，2012，40（3）：249-252.

[14] 徐旭耀，王汝娟，谢伟飞.柑橘皮中川陈皮素超声提取工艺及含量分析[J].食品工业科技，2012，33（9）：301-304.

[15] 李成平，田红梅，金在宿，等.微波辅助提取橘皮中川陈皮素和橘红素的工艺研究[J].食品科技，2011，36（5）：224-228.