湖南怀化地区三带喙库蚊和猪自然感染乙脑病毒调查*

陈 晨 郭晓霞 蒋 勇 宋世佩 李春晓 赵彤言

(1.军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071；2.第二炮兵疾病预防控制中心，北京 100071；3.解放军96301部队防疫所，湖南怀化 418008)

日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是世界上重要的病毒性脑炎病原体之一(Ghoshetal.，2009)，全球每年约有65万乙脑病例发生，其中50%发生在中国。我国湖南省自50年代起一直是乙脑流行区，1951～2000年乙脑年平均发病率为5.82/10万，在2013年7月湖南省公布的乙脑报告病例中，怀化市报告乙脑发病数列居前位(郭绶衡，2002)。怀化市位于湖南省西部偏南，属中亚热带季风气候区，四季分明，光热资源丰富，雨量充沛，为三带喙库蚊Culextritaeniorhynchus的繁殖提供了良好的孳生环境。尽管该地区有乙脑病例报道，但是没有检测和分离到乙脑病毒的研究报告，乙脑病毒在三带喙库蚊和猪中的自然感染状况尚不清楚。

本研究通过2012～2013连续两年对湖南怀化地区两个村落进行三带喙库蚊和猪脑样本的采集，经实验室乙脑病毒核酸检测，研究蚊和猪体内乙型脑炎病毒自然感染状况，为该地区乙型脑炎的防控和流行趋势的预测提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1蚊虫样本：采自湖南怀化北部炉天冲村、南部池回村采集，液氮保存，干冰运输送至实验室-80 ℃保存。

1.1.2猪脑：为从湖南怀化现场采集经液氮保存、干冰运输送至实验室-80 ℃保存待检的样品。

1.2 方法

1.2.1蚊虫样本采集：2012～2013年选择湖南省怀化市往年气温较高、雨水较多的七、八月份，选择北部炉天冲村和南部池回村2个村落，每个村落选择猪圈、稻田和人居3个不同生境，于每日18:00～20:30将二氧化碳诱蚊灯(MT-1二氧化碳诱蚊灯)挂放于离地1 m处位置捕获蚊虫，带回实验室麻醉并分类计数，放入1.5 mL冻存管(每管30～50只)中，完整记录信息(包含采集时间、地点、蚊虫种类、数量)后装入布袋，置液氮罐中冻存。

1.2.2猪脑样本采集：选择蚊虫采样点周边(猪圈)的出栏猪，宰杀后立即利用自制长弯钩采集猪脑组织(约5 g/头)，信息记录完整后分装入1.5 mL冻存管中。

1.2.3引物设计与合成：依据文献合成了检测蚊虫和猪体内乙脑病毒扩增引物序列(潘晓玲，2009)，引物由上海生物技术有限公司合成。上游引物J1：GTGCCATTGACATCACAAG，下游引物J2：TGTCTCAGGTCCATCTACG。扩增区间：2 418～2 826，扩增片段长度为409 bp。

1.2.4蚊虫及猪脑携带病毒RNA的提取及逆转录反应：蚊虫RNA提取：采用北京吉百特公司研制的柱提法提取蚊虫RNA，可避免蚊虫体内色素干扰RNA质量。猪脑RNA采用传统Trizol法提取。

逆转录反应：配制为反应体积10 μL的反转录体系：Mgcl22 μL，10×RT Buffer 1 μL，dNTP Mixture 1 μL，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL，Random 9 mers 0.5 μL，RNase Inhibitor 0.25 μL，RNase Free dH2O 2.75 μL，上述提取的RNA 2 μL。逆转录反应条件如下：30 ℃ 10 min，45 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。逆转录产物保存于-20 ℃备用。

1.2.5PCR反应:取上述逆转录反应产物5 μL进行PCR扩增病毒，将下列试剂加入200 μL离心管中，配制为反应体积为25 μL的PCR反应体系：上下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，Taq酶套餐12.5 μL，H2O 6.5 μL， cDNA 5 μL。PCR反应条件为95℃，3 min；94℃，40 s，56℃，40 s，72℃，1 min，40个循环；72℃延伸10 min。1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定并拍照记录结果。

1.3 统计分析

最小感染率=1/蚊虫总数。实验数据采用SPSS13.0软件进行统计分析，组间采用卡方检验，P<0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 三带喙库蚊乙脑病毒自然感染结果

2012年在怀化北部炉天冲村、南部池回村分别采集三带喙库蚊3 260、7 841只，分别分装为68份和157份样本，经检测，北部炉天冲村有2份样本呈乙脑病毒阳性，样本阳性率为2.94%，南部池回村有3份样本呈乙脑病毒阳性，阳性率为1.91%(表1)。经卡方检验，χ2=0.23，P>0.05，两个村落三带喙库蚊乙脑病毒阳性率无统计学差异。

表1 2012年三带喙库蚊乙脑病毒感染情况Tab. 1 The infection rate of Japanese encephalitis virus in Cx.tritaeniorhynchus in 2012

2013年在怀化北部炉天冲村、南部池回村分别采集三带喙库蚊3 004、5 209只，分别分装为70份和97份样本，经检测，北部炉天冲村有1份样本呈乙脑病毒阳性，样本阳性率为1.43%，南部池回村有5份样本呈乙脑病毒阳性，阳性率为5.15%，见表2。经卡方检验，χ2=1.63，P>0.05，两个村落三带喙库蚊乙脑病毒阳性率无统计学差异。

假设每只阳性样本管中只有一只携带乙型脑炎病毒的蚊虫，那么2012年北部炉天冲村和南部池回村的蚊虫样本乙脑病毒的最小感染率分别(周晓俊，2007)为0.613/1 000，0.382/1 000；2013年北部炉天冲村和南部池回村的蚊虫样本乙脑病毒的最小感染率分别为0.333/1 000，0.960/1 000，见表3。

2012年阳性样本仅来自稻田，2012年稻田样本阳性率为2.03%，2013年三种生境均出现阳性样本，2013年稻田样本阳性率为1.82%，猪圈样本阳性率为1.49%，人居样本阳性率为4.76%，2013年三种生境间三带喙库蚊乙脑病毒阳性率无显著差异。

表2 2013年三带喙库蚊乙脑病毒感染情况Tab. 2 The infection rate of Japanese encephalitis virus in Cx.tritaeniorhynchus in 2013

表3 三带喙库蚊乙脑病毒生境分布情况Tab.3 Habitat distribution of JEV infected Cx.tritaeniorhynchus

2.2 猪乙脑病毒自然感染的研究

2012年在北部炉天冲村采集的55头猪的脑中检测到6头猪感染乙型脑炎病毒，2013年在南部池回村采集的79头猪的脑中检测到16头猪感染乙型脑炎病毒，猪样品乙脑病毒阳性分别为：2012年10.91%，2013年20.25%。见表4。经卡方检验，χ2=1.51，P>0.05，2012和2013年猪感染三带喙库蚊乙脑病毒阳性率无统计学差异。

2.3 蚊虫、猪体内乙脑病毒核酸检测

分别对蚊虫、猪脑样本进行组织研磨、RNA提取，运用乙脑病毒特异性引物进行RT-PCR检测，扩增出目的条带，条带大小与预期一致(图1～2)。所得序列在Genbank基因库中比对结果显示与乙型脑炎病毒序列(AB196925.1)相似率高达99%。

表4 猪乙脑病毒感染情况Tab. 4 The infection rate of Japanese encephalitis virus in pigs

图1 2013年怀化蚊虫乙脑PCR检测结果Fig.1 PCR analysis of JE virus in Cx.tritaeniorhynchus in 2013M: DL2000 分子量标准； 1～13： 三带喙库蚊样本，其中1,2,5为阳性样本； 14： 阴性对照。M： DL2000; 1-13: Samples of Cx.tritaeniorhynchus, 1, 2, 5 are positive samples； 14： Negative control.

图2 2012-2013猪脑乙脑PCR检测Fig.2 PCR analysis of JE virus in pig′s brain in 2012 and 20131～22：22份携带乙脑病毒的猪脑样本。1-22：22 samples of pig′s brain with JE virus.

3 讨论

湖南省位于我国华中地区，毗邻多个省份，湖南省怀化市以水稻种植为主，而稻田是三带喙库蚊重要的孳生地，据本次调查，该地区蚊种构成比较简单，三带喙库蚊为当地的优势种。三带喙库蚊主要栖息于猪场、人房，是夜间活动的主要蚊种，其分布、季节高峰及嗜叮人、畜的特点与乙脑发病吻合，是当地乙脑主要传播媒介。

自我国学者1938年通过血清学实验证实乙型脑炎已在中国流行(Huang，1941),于1940年又在北京分离到第一株乙脑病毒(Yen，1941)，以后的70多年间，在中国各地分离到大量的乙脑毒株。特别是近年来我国开展了乙脑监测工作，数据显示，在近30年间随着环境变化、人口迁移、贸易往来等生态、自然社会条件变化，我国乙型脑炎病毒呈现出从基因Ⅲ型到Ⅰ型的演变趋势，基因Ⅰ型正在逐渐取代基因Ⅲ型成为优势基因型(陈柠等，2013)。本研究从怀化地区自然界乙脑传播循环的关键环节——媒介蚊虫和猪体内分离到乙脑病毒，村落中三带喙库蚊乙脑阳性率在1.43%～5.15%，猪样本阳性率高达10.91%～20.25%，表明该地区蚊虫和猪感染乙型脑炎病毒较普遍，从不同生境样本阳性率上看，稻田、猪圈、人居环境乙脑病毒均有分布，其中人居环境较高为4.76%，表明该地区乙脑病毒已在自然环境中广泛存在，且人群有感染乙脑病毒的可能性应引起媒介防控工作者注意。

通过核酸检测，将所测序列与GenBank中序列进行比对，发现该地区乙脑病毒与基因Ⅲ型乙脑病毒重合率高达99%，基因型别的确定为了解该地区乙型脑炎流行株的分类地位和分子特征，指导该地区乙型脑炎的防控，预测当地乙脑流行趋势提供数据支撑。

我国乙脑流行的地域范围进一步扩大。随着西藏分离出XZ0934株、新疆分离出XJ/08/01株(Lietal.，2011)，我国除青海外的各个省份均已有关于乙脑的报道(胡仓云，2014; 曾阳等，2014)。怀化市又地处四季分明，雨量充沛，适宜蚊虫滋生繁殖的中亚热带季风气候区，因此，防控蚊媒疾病传播，特别是预防乙脑疾病暴发的工作不能放松。