河北省甘薯茎腐病研究初报

高 波, 王容燕, 马 娟, 李秀花, 陈书龙

(河北省农林科学院植物保护研究所,河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心,农业部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室, 保定 071000)



河北省甘薯茎腐病研究初报

高 波, 王容燕, 马 娟, 李秀花, 陈书龙*

(河北省农林科学院植物保护研究所,河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心,农业部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室, 保定 071000)

甘薯茎腐病是近几年在我国发现的一种新的细菌性病害,目前该病已在我国的福建、广东、江西、广西、海南、河南、重庆、江苏等地发生。2013年10月在对河北省甘薯病害的调查中在文安县发现了大量疑似甘薯茎腐病的病株,给当地的甘薯生产造成了严重的影响。经对疑似病株病原菌的分离纯化、柯赫氏法则验证、形态观察以及基于16S rDNA序列的分析,最终确定该病害为甘薯茎腐病,病原菌为达旦提狄克氏菌(Dickeyadadantii)。这是该病害首次在河北省被发现。

甘薯茎腐病; 细菌性病害; 达旦提狄克氏菌

甘薯[Ipomoeabatatas(L.)Lam.]在我国是继小麦、水稻、玉米、大豆之后的第五大粮食作物,种植面积和总产量分别约占世界的70%和85%,常年种植面积在700万hm2左右[1],但病虫害的发生却严重地制约着我国甘薯的产量和品质。

甘薯茎腐病(又名甘薯黑腐病)是国内外甘薯生产上的重要病害之一,是由达旦提狄克氏菌(Dickeyadadantii)(又名Erwiniachrysanthemi)引起的一种细菌性病害。该病于1974年在美国的乔治亚州首次暴发流行,给该州的甘薯产业造成了严重的影响。该病的病原最初由Martin等[2]鉴定为胡萝卜软腐欧文氏菌(E.carotovora),之后Schaad等[3]通过对比3种欧文氏菌的生理生化指标最终确定引起甘薯茎腐病的病原为E.chrysanthemi,对14个甘薯品种的抗病性进行检测发现所有品种均不具抗性。该病菌寄主范围广泛,除危害甘薯外,还可侵染菊花、雏菊、烟草、番茄、马铃薯、茄子、卷心菜、大豆、矮牵牛等多种植物。1989年,Clark等[4]研究发现甘薯茎腐病的发病率与病原菌的侵染浓度、甘薯的品种抗性以及甘薯受侵染的部位有关。1992年,Duarte等[5]对该病的病害循环进行研究发现携带病菌的薯块和茎蔓都能成为来年的初侵染源。2005年,Samon等[6]对庞杂的E.chrysanthemi重新进行分类并建立了Dickeya属,设定了4个新种D.dadantii、D.dianthicola、D.dieffenbachiae和D.zeae。甘薯茎腐病在我国最早于1990年在福建地区暴发流行,根据其症状特点初步被鉴定为Erwiniasp.[7]。2010年Huang等报道了该病在我国广东地区的暴发流行,并根据病原菌的形态特征、培养性状、生理生化及16S rDNA序列分析,以及最新的分类系统将其鉴定为D.dadantii[8]。目前该病已在我国的福建、广东、江西、广西、海南、河南、重庆、江苏等地发现,且已经成为南方薯区发病面积最大、危害最重的病害之一[9-10]。

2013年我们在甘薯病害调查中,于河北文安县发现一种与甘薯茎腐病相似的病害,主要症状表现为甘薯茎基部腐烂变褐,地下薯块呈水浸状腐烂,掰开后呈“烤红薯”状,田间发病率在5%左右(n=50×3),受害植株基本无产量。本文主要对疑似病株的病原菌进行了分离、鉴定和回接验证,以确定病害种类,并为北方薯区甘薯病害的识别及防治提供依据。

1 材料和方法

1.1 病原菌分离

2013年10月从河北文安县采集‘龙薯9号’发病的薯块,切取病健交界处组织,捣碎后用接菌环蘸取菌液画线接种于LB平板上,30 ℃培养24 h,单菌落纯化3次后,于LB液体培养基中振荡培养,获得菌液于4 ℃保存备用。

1.2 柯赫氏法则回接鉴定

1.2.1 接种茎蔓

将获得的菌株于LB固体培养基上画线,30 ℃培养24 h后挑取单菌落,于30 ℃,180 r/min摇菌培养,直至A值达0.6～1.0。将带有3～4片叶子的甘薯‘龙薯9号’茎蔓切口浸蘸菌液20 min后栽种到盛有灭菌土的花盆中,以蘸灭菌水的茎蔓为空白对照,置于光照培养箱中,30 ℃,L∥D=16 h∥8 h,每天适量浇水保持土壤湿度,并观察发病情况。取发病植株按照1.1中方法分离病菌。

1.2.2 接种薯块

剪取0.5 cm×0.5 cm的滤纸片蘸取菌液后贴附于薯块的针刺微创口处,以蘸灭菌水的滤纸片为对照,每菌株3个重复。接种后的薯块置于湿润的沙土中,30 ℃保湿培养,每隔24 h观察1次发病情况。取发病组织按照1.1中的方法再次分离病菌。

1.3 病原菌形态观察

将分离的菌株接种到LB平板上,30 ℃培养24 h后,挑取少量菌体进行革兰氏染色,显微镜下对菌体进行观察,记录其形态、大小,颜色反应等。

1.4 病原菌分子鉴定

1.4.1 病原菌16S rDNA的扩增

利用微波法快速制备细菌的基因组DNA[11],根据Blackwood等[12]的报道合成细菌鉴定通用引物8F/1492R(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),并以细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为：2×EsTaqMasterMix(北京康为世纪公司)10 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA模板1 μL,加ddH2O至20 μL。反应程序为：94 ℃,3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,共30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR 产物经1%的琼脂糖凝胶电泳,EB染色,用凝胶成像系统观察、拍照,用琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京康为世纪公司)回收目的条带。

1.4.2 16S rDNA的克隆、测序以及比对分析

将回收纯化后的PCR产物与pMD18-T载体4 ℃过夜连接,连接产物用热激法转化感受态大肠杆菌DH5α,并于含氨苄青霉素(50 mg/L)的LB固体培养基上培养12～14 h筛选阳性克隆。挑取单菌落用4 mL含氨苄青霉素(50 mg/L)的LB液体培养基扩大培养,将获得的菌液利用质粒小提试剂盒(北京康为世纪公司)提取质粒后进行PCR验证。最后将经PCR验证的阳性克隆(至少3个)送至上海生工生物工程有限公司进行测序。利用DNAstar软件包的SeqMan进行序列拼接比对。所得序列提交NCBI数据库进行BLAST比对分析。采用MEGA 5.2软件包中的Neighbor-Joining(NJ)聚类分析法对所测定的序列进行聚类分析。

2 结果和分析

2.1 症状观察

病害发生地点为河北省文安县大柳河镇北张村,甘薯品种为‘龙薯9号’。收获时,发现有些植株薯蔓与薯块相连处变褐腐烂,严重的整块薯腐烂,有酸腐的味道,薯块表皮没有明显的病斑,地上部的薯秧、叶片正常,没有表现症状,发病率在5%左右(n=50×3)。

从采集的病薯上共分离得到了3株细菌菌株,将它们分别进行回接。在薯块上,只有接种WA1301菌株的薯块在接种2 d后发病,症状表现为接种点周围外表皮完好,内部变褐并软化腐烂,7 d后薯块有80%以上腐烂,外表皮仍然保持完好,薯块掰开后内部呈现水浸状腐烂,形如“烤红薯”(图1b、c)。在甘薯茎蔓上,同样是只有接种WA1301的茎蔓发病,其发病速度比薯块慢,在10 d后才开始出现明显症状,主要表现出生长缓慢,叶片黄化萎蔫,茎基部有褐色腐烂斑,拨开土壤发现土层以下部分已经褐化腐烂(图1a)。以上薯块和茎蔓上的发病症状均与田间症状一致,另外从发病的茎蔓和薯块中均又重新分离到了相似的菌株,说明WA1301为其病原菌。切开发病薯块观察发现,其发病部位主要是沿着薯块的中心向两头不断发展,且韧皮部早期并未发现有褐化的现象。

图1 回接菌株WA1301的甘薯秧苗及薯块的发病症状 Fig.1 Symptoms of the sweet potato stem and storage root inoculated with strain WA1301

2.2 病原菌形态

WA1301菌体短杆状,大小为(0.5～0.8)μm×(1. 0～2. 7)μm,革兰氏染色阴性,在LB培养基上30 ℃培养24 h后,菌落呈浅黄色,边缘整齐。

2.3 病原菌分子鉴定

对WA1301菌株进行16S rDNA扩增，获得了一条约1 500 bp的条带,切胶回收该条带并进行克隆后测序,最终获得的序列为1 503 bp(登录号：KJ541470)。将获得的序列提交GenBank数据库进

行BLAST比对分析,结果显示该菌株的16S rDNA与D.dadantii模式菌株3973(登录号：CP002038)以及Huang等[8]报道的E.chrysanthemi菌株H12(GU252371)和09-1(HM222417)的相似性均达99%。将WA1301菌株与其他狄克氏菌属菌株一起构建系统发育树(图2),结果显示WA1301菌株与D.dadantii聚为一簇。综合回接病株症状以及分子鉴定结果,证明在河北文安甘薯田发现的细菌性腐烂病为甘薯茎腐病。

图2 利用邻接法基于16S rDNA序列构建的系统发育树Fig.2 Neighbor-Joining tree calculated from the 16S rDNA sequences

3 讨论

本研究从甘薯发病组织中分离获得了3种菌落形态的菌株,经回接后确定WA1301为致病菌,通过分子生物学方法对其16S rDNA进行测定和分析,并结合其致病症状表现最终确定其为达旦提狄克氏菌(D.dadantii),该病菌在甘薯上危害造成甘薯茎腐病发生,这是我国首次在河北省发现甘薯茎腐病。

方树民[7]和Huang等[8]先后在我国福建和广东地区发现并报道了甘薯茎腐病的发生,本研究中发病的甘薯苗以及薯块的症状表现均与其描述一致。甘薯瘟病(Ralstoniasolanacearum)是甘薯生产上的另一种重要病害,甘薯茎腐病与薯瘟病同属细菌性病害,但两者在症状上具有一定区别,薯瘟病危害初期在甘薯的茎蔓或薯块不显症状,而剖开后可见其维管束变黄或变褐,并呈现条纹状,病株于晴天中午萎蔫呈青枯状[13],而根据我们的观察茎腐病并没有这些症状。

D.dadantii可以侵染多种观赏性园艺植物和农作物[14],导致其发生软腐病,严重威胁着我国多种作物的生产。由该菌引起的甘薯茎腐病于1990年在我国福建首次暴发并被报道以来[7],目前已遍布我国的南方薯区以及河南和江苏等地的部分甘薯种植区[9-10],但还未见有在华北地区发生的报道。该病今年在我国北方薯区形成危害可能有以下几方面原因[3, 15]：1)D.dadantii的寄主广泛,且致病性强,不排除从其他作物上传播而来的可能性;2)带菌种苗或种薯在市场上的流通,很可能使得甘薯在育苗期即形成了初侵染;3)病原菌通过田间的农事操作进一步扩大了发病面积;4)与当地的气候条件有关,病原菌侵染的最适温度在30 ℃左右[3],但是可以在低于27 ℃的很大范围内存活。河北2013年夏季雨量偏多,文安县发病的甘薯田地势低洼,形成了高温高湿的环境,有利于病原菌的侵染和繁殖,从而导致该病的暴发。综上所述,甘薯茎腐病的发生应该引起北方甘薯种植区的足够重视,从选育抗病品种、培育无病壮苗、田间排水排涝、硫酸链霉素浸秧喷雾等入手[15],做好综合防治工作。

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(责任编辑：杨明丽)

A preliminary study on bacterial stem and root rot disease of sweet potato in Hebei Province

Gao Bo, Wang Rongyan, Ma Juan, Li Xiuhua, Chen Shulong

(Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences; IPM Centre of Hebei Province; Key Laboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture, Baoding 071000, China)

The bacterial stem and root rot disease of sweet potato was a novel bacterial disease reported in China, which has occurred in the provinces of Fujian, Guangdong, Jiangxi, Guangxi, Hainan, Henan, Chongqing, Jiangsu and so on in recent years. In the survey of sweet potato diseases in Hebei Province in October 2013, a lot of sweet potato plants with similar symptoms of bacterial stem and root rot disease were found in the County Wen’an, which caused a serious loss to the local sweet potato production. In this study, bacterial strains were isolated and purified from the diseased tuberous roots. The pathogen of the disease was verified based on the Koch’s postulates and finally identified asDickeyadadantiiby morphological observation and the 16S rDNA sequence analysis. This is the first report on this disease in Hebei Province.

bacterial stem and root rot disease of sweet potato; bacterial disease;Dickeyadadantii

2014-03-18

2014-05-09

国家甘薯产业技术体系(CARS-11-B-08)

S 432.42

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.023

* 通信作者 E-mail:chenshulong@gmail.com