小麦矮缩病毒NASH快速检测方法的建立及应用

金 文, 张金良, 刘 艳*, 王锡锋

(1.中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193; 2.北京市植物保护站,北京 100029)



小麦矮缩病毒NASH快速检测方法的建立及应用

金 文1, 张金良2, 刘 艳1*, 王锡锋1

(1.中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193; 2.北京市植物保护站,北京 100029)

以非放射性物质地高辛为标记物,采用PCR法制备了特异性强、灵敏度高的DNA探针。通过优化反应体系, 建立了小麦矮缩病毒(Wheatdwarfvirus, WDV)的核酸斑点杂交 (nucleic acid spot hybridization,NASH)快速检测技术体系。该方法诊断准确率高,操作简单,周期短,整个检测过程仅需5 h左右。利用建立的NASH技术开展WDV流行学调查,发现近年来WDV在我国陕西韩城、山西太原和河北石家庄等地区点片发生,没有大面积暴发成灾。

小麦矮缩病毒; 地高辛; 核酸斑点杂交(NASH); 快速检测

小麦矮缩病毒(Wheatdwarfvirus,WDV)是一类侵染麦类作物的双生病毒,为双生病毒科(Geminiviridae)玉米线条病毒属(Mastrevirus)的成员[1-2]。该病毒由条沙叶蝉(PsammotettixstriatusL.)以持久性非增殖方式传播[3],寄主为小麦、大麦、燕麦和多种禾本科杂草,罹病植株表现为矮化、黄化、分蘖增多等[4],它的局部流行曾对欧洲多个国家的大麦、小麦生产造成很大危害[5-7]。2007年我国首次报道了小麦矮缩病毒在山西太原发生[8],随后在陕西、甘肃、河北和云南等12个省均有发现。近年来在陕西北部麦区已引起严重减产,正成为威胁我国西北、华北和西南麦区重要的病毒病[9-11]。建立适合田间大量样品鉴定的快速检测方法,做到早期发现与预警,对及时有效地控制该病害将起到重要的作用。

植物病毒的检测方法通常有生物学、血清学和分子生物学等手段。但就小麦矮缩病毒而言,由于该病毒为虫传病毒,其传播介体条沙叶蝉饲养困难,生物学鉴定难度很大;血清学具有快速简便、高通量等优点,但对制备抗体的特异性有较高要求;PCR法较为常用,但存在因交叉污染而带来的假阳性等问题。核酸斑点杂交技术(nucleic acid spot hybridization,NASH)具有特异性强、灵敏度高等特点[12],尤其是非放射性标记如地高辛的发展使得这种方法得到更广泛的应用[13],近年来NASH技术已广泛应用于植物病毒的检测中[14-15]。本研究制备了基于地高辛标记的DNA探针,将NASH检测技术用于小麦矮缩病毒(WDV)的快速诊断和鉴定。

1 材料与方法

1.1 毒源及传毒介体

小麦矮缩病毒(WDV)分离物和传毒介体(条沙叶蝉)均采自陕西韩城小麦矮缩病毒病发病田块。经 PCR检测和基因测序确定为小麦矮缩病毒(WDV)后,在感病小麦品种(‘扬麦12’)上繁殖毒源。条沙叶蝉经脱毒纯化后在健康小麦上扣罩饲养。上述毒源和介体均在22 ℃,20 000 lx条件的光照培养箱中常年繁殖。小麦黄矮病毒GPV株系(Wheatyellowdwarfvirus-GPV, WYDV-GPV)及大麦黄矮病毒(Barleyyellowdwarfvirus, BYDV)的GAV株系和PAV株系等参照毒源均为本实验室-70 ℃保存样品。

1.2 探针引物的设计、合成与标记

将GenBank上登录的WDV陕西韩城分离物与其他地区分离物进行序列比对,结果表明外壳蛋白(coat protein, CP)基因较为保守,故选取该基因作为靶基因。应用Vector NT 10.0软件设计CP基因特异性引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。具体序列为CP/F: 5′-ATGGTGACCAACAAGGACTCC-3′;CP/R:5′-TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3′。DIG探针标记采用PCR法,用试剂盒(DIG PCR probe synthesis kit,Roche)中的DIG-dNTPs(含0.7 mmol/L DIG-11-dUTP,1.3 mmol/L dTTP)代替PCR正常体系中的dNTPs进行PCR扩增。

1.3 WDV-CP基因的克隆

PCR扩增反应体系为：模板DNA 1 μL,10 μmol/L正反向引物各0.5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,5U ExTaq酶0.25 μL,10×buffer 2.5 μL,加ddH2O至25 μL。在Eppendorf PCR仪中按下列扩增程序进行：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,56 ℃复性45 s;72 ℃延伸1 min,35次循环;最后72 ℃ 延伸10 min,4 ℃下保存备用。将纯化好的PCR产物连接至pMD-18T载体(TaKaRa)上,转化到DH 5α大肠杆菌感受态中。经PCR鉴定选取3个阳性克隆由生工生物工程(上海)股份有限公司完成序列测定。

1.4 WDV-NASH检测方法的建立

采用CTAB法提取样品的总DNA：取1 μL点于尼龙膜(Amersham HybondTM-N+,GE Healthcare)上,将膜放在UV紫外交联仪中固定;将固定好的杂交膜放入杂交袋中,加入适量杂交缓冲液后50 ℃下预杂交15 min;将DIG探针100 ℃变性5 min后加入杂交液中,50 ℃杂交1.5～2 h;膜置于足量的2×SSC(含0.1% SDS)溶液中,振荡漂洗2次,每次10 min;转入足量的0.5×SSC (含0.1% SDS)的溶液中,65 ℃条件下轻微振荡漂洗2次,每次10 min;用封闭缓冲液轻摇封闭20 min。

采用免疫显色：加入碱性磷酸酶标记的DIG抗体(Roche公司)达到工作浓度为1∶7 500,室温孵育30 min;洗涤液(0.1 mol/L maleic acid,0.15 mol/L NaCl, pH 7.5,含0.3% W/V Tween-20)洗膜2次,每次10 min;加入适量含330 μg/mL NBT和165 μg/mL BCIP的碱性磷酸酯酶缓冲液(现用现配);暗处显色约20～30 min,用50 mL无菌双蒸水或TE buffer 将膜漂洗5 min,终止显色反应。

1.5 NASH特异性和灵敏度检测

取1 μL小麦矮缩病毒DNA提取液,同时以健康小麦DNA提取液和感染小麦的其他病毒WYDV-GPV、BYDV-GAV和BYDV-PAV的cDNA作为对照,按照建立的NASH检测方法进行特异性检测;将小麦矮缩病毒DNA模板进行10倍系列梯度稀释,得到10-1～10-6倍的稀释液,进行灵敏度检测试验。

1.6 大田疑似WDV样品的检测

2010年至2013年间,于每年小麦生长季在我国主要麦区采集严重矮化、分蘖增多、黄化且不能抽穗的小麦矮缩病毒疑似标样。每份标样称取0.1 g,采用CTAB法提取样品的总DNA,溶解于0.1×TE 溶液中,-20 ℃暂存备用。采用1.4中建立的WDV-NASH技术进行检测。

2 结果与分析

2.1 WDV-CP基因的克隆

从繁殖WDV毒源的小麦叶片中提取总DNA,采用1.2中设计的特异性引物对(CP/F和CP/R)扩增获得了大小约为780 bp的条带(图1泳道1), 与预期CP基因目的片段大小(783 bp)基本一致。将回收纯化的CP基因扩增产物与载体pMD-18T连接,并转化至大肠杆菌中,经PCR鉴定和序列测定获得含WDV-CP基因的重组质粒。

2.2 地高辛标记探针的制备

以获得的含WDV-CP基因的重组质粒为模板,采用DIG标记PCR法制备探针。反应结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳,因DIG的分子量大,从图中可以看出已标记的条带(图1泳道2)明显滞后于普通未标记的条带,说明此探针标记成功。

图1 PCR法制备WDV特异性DIG探针的电泳图Fig.1 Gel analysis of PCR-amplified specific DIG-labeled probe for WDV

2.3 探针特异性检测

将已提取的WDV、WYDV-GPV、BYDV-GAV和BYDV-PAV等病毒核酸各取1 μL点于同一张尼龙膜上,以健康小麦DNA作为阴性对照,用制备的WDV特异的DIG核酸探针进行核酸斑点杂交。结果显示：该探针仅与WDV样品DNA产生反应(图2)。表明此探针具有较强的特异性,可以用于鉴别区分WDV和与其症状相似的小麦上其他病毒。

图2 WDV-CP探针的特异性检测Fig.2 Detection for the specificity of WDV-CP probe

2.4 探针灵敏度检测

提取3份WDV样品DNA,编号为1～3。用Nanodrop微量测定仪测定核酸浓度,1～3号样品的浓度分别为1 501.4、904.7和1 647.7 ng/μL。分别取1 μL DNA,按10-1～10-6系列比例用ddH2O稀释DNA,然后按稀释顺序点于同一张尼龙膜上进行斑点杂交。杂交显色结果(图3)表明10-2稀释倍数能得到较为清晰的DNA印迹,10-3稀释倍数仍能检测到DNA,该试验3次重复的平均灵敏度为1.33 ng/μL。

图3 WDV-CP探针的灵敏度检测Fig.3 Detection for the sensitivity of WDV-CP probe

2.5 大田疑似样品的检测

采用建立的WDV-NASH技术,对2010年至2013年采自山西、陕西、山东、河北、云南和四川等12个省份部分地区的373份WDV疑似标样进行了检测。取标样DNA 1 μL点于尼龙膜上,并分别以已知WDV毒源样品和样品缓冲液为阳性对照和空白对照，部分杂交结果见图4。结果表明近几年来小麦矮缩病毒在陕西韩城、山西太原和河北石家庄等地区点片发生,没有大面积暴发。将检测样品同时用PCR方法验证,准确率达99%以上。

图4 部分大田标样的核酸斑点杂交检测结果Fig.4 Detection of samples collected from fields by NASH assay

3 讨论

WDV一旦发生,其造成的经济损失就会相当严重,所以各发生国家都十分重视对该病害的流行监测。依赖于抗血清的WDV检测技术以ELISA技术最成熟,应用最广泛。但由于受到抗血清制备水平的限制,国内尚无商品化的抗血清;以分子生物学技术为基础,已经开发出如qPCR[16]和RCA-RAPD[17]等针对WDV的检测技术,但是这些技术不易掌握,且受到试剂和仪器昂贵等成本问题影响,难以在基层植保部门推广。

本研究首先对WDV病毒及其近似种的核苷酸序列进行系统分析,设计了用于特异性检测WDV的CP基因特异性引物,并对反应条件进行了优化,建立了以地高辛标记的DNA探针为基础的NASH检测技术。免疫检测结果表明：制备的含WDV-CP的DNA探针具有较强的特异性和高灵敏度,并成功地应用于田间疑似WDV标样的检测。该探针的制备方法简单,具有无放射性污染的优点,且可反复使用4～5次,节约了检测成本。将制备的地高辛探针、杂交缓冲液和洗涤液等反应体系成分组装成试剂盒后,无需PCR、酶联测定仪等任何昂贵的仪器,操作简单方便,对基层单位十分适用,具有良好的应用前景。

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(责任编辑：杨明丽)

Development and application of nucleic acid spot hybridization (NASH) assay for rapid detection ofWheatdwarfvirus

Jin Wen1, Zhang Jinliang2, Liu Yan1, Wang Xifeng1

(1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2.Beijing Plant Protection Station, Beijing 100029, China)

In this study, a nucleic acid spot hybridization (NASH) method was developed to detectWheatdwarfvirus(WDV). Based on digoxigenin (non-radioactive)-labeled strategy, a DNA probe with well-characterized specificity and sensitivity was prepared by PCR.The reaction system was optimized for highly accurate diagnosis and simple operation. The whole process of assay was rapid and efficient, which could be completed in 5 h. The established system was applied to epidemiological survey of WDV.The results indicated that no large-scale outburst of WDV has occurred in China in recent years, and it only happened sporadically in local areas, including Hancheng (Shaanxi Province), Taiyuan (Shanxi Province) and Shijiazhuang (Hebei Province).

Wheatdwarfvirus(WDV); digoxigenin; nucleic acid spot hybridization (NASH); rapid detection

2014-04-16

2014-07-21

国家自然科学基金(31171820)；北京市粮食高产创建项目(PXM2013-036203-000022);粮食作物产业技术体系北京市创新团队项目

S 435.121.5

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.019

* 通信作者 E-mail:yliu@ippcaas.cn