维生素D对牛卵巢卵泡颗粒细胞的影响

靳 光，张元庆，张喜忠，王 曦，王栋材，李 博，薛艳蓉

（山西省农科院畜牧兽医研究所，太原 030000）

繁殖与生理

维生素D对牛卵巢卵泡颗粒细胞的影响

靳 光，张元庆，张喜忠，王 曦，王栋材，李 博，薛艳蓉

（山西省农科院畜牧兽医研究所，太原 030000）

试验旨在探寻具有生物活性的维生素D（1α，25-（OH）2D3）对体外培养的牛卵巢卵泡颗粒细胞的活力、增殖及雌激素分泌的影响。在体外培养的牛卵巢卵泡颗粒细胞中加入不同梯度的1α，25-（OH）2D3（0，1，10，100 nM），用CCK-8检测细胞活力，细胞计数检测增殖，ELISA法检测雌二醇浓度。结果表明：1、10、100 nM的1α，25-（OH）2D3均能提高卵泡颗粒细胞的活性，1α，25-（OH）2D3为100 nM时其刺激作用最强；10、100 nM的1α，25-（OH）2D3能刺激卵泡颗粒细胞增殖与雌二醇分泌，100 nM的1α，25-（OH）2D3刺激增殖作用最强，10 nM的1α，25-（OH）2D3刺激雌二醇分泌的能力最强。

维生素D；牛；卵泡颗粒细胞；细胞活力；增殖；雌二醇

维生素D是一种脂溶性维生素，其主要作用是升高血浆中钙、磷的水平，以促进骨的钙化。维生素D可以通过食物摄取也可以在体内合成。维生素D在体内代谢产物有数十种，但在体内最终的活性形式只有一种，那就是1α，25-二羟维生素D3（1α，25-（OH）2D3）［1-2］。

1α，25-（OH）2D3发挥其生物学作用需要靶细胞上维生素D受体（VDR）的介导。VDR是核受体家族成员之一，调控了人及小鼠约3%的基因表达［1，3］。随着研究的深入，人们发现VDR存在于雄性动物的睾丸、附睾、前列腺、精囊腺等重要器官［4-5］。另外，在人精子内VDR存在于精子细胞核内［6］。VDR在雄性动物生殖系统内的表达，说明1α，25-（OH）2D3能够在其中发挥调节作用。

维生素D对生殖的影响已有诸多研究。对于VDR基因敲除的小鼠其精液品质下降，表现为精子数目与精子活率降低，精子形态异常［7］。对于未成熟大鼠的睾丸支持细胞，1α，25-（OH）2D3能够提高芳香化酶（控制雌激素生成的关键酶）mRNA的表达量［8］。对于精子，1α，25-（OH）2D3能够增加精子细胞内钙离子浓度，提高精子运动能力和顶体酶活性，有利于精子获能并延长精子体外生存时间［9-10］。

虽然维生素D对于雄性动物生殖的影响已有大量研究，但是对于雌性动物的研究较少，并且维生素D对母牛生殖方面的研究还未见报道。因此，本试验以母牛为研究对象，探究维生素D对母牛卵巢卵泡颗粒细胞的细胞活力、增殖以及雌激素分泌水平的影响。

1　材料与方法

1.1样品采集

选取健康的成年山西省晋南牛作为研究对象，在当地屠宰场将动物宰杀后采集卵巢。迅速用生理盐水冲洗卵巢并放入4℃无菌PBS缓冲液内，2 h内带回实验室。

1.2主要试剂

DMEM/F12基础培养基、青链霉素混合液、Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒购于武汉博士德生物公司；胎牛血清（FBS）购于杭州四季青公司；牛雌二醇ELISA试剂盒购于上海蓝基生物公司；1α，25-（OH）2D3购于Selleck公司。

1.3牛卵巢卵泡颗粒细胞的收集

无菌条件下将卵泡从卵巢上剪下，然后剪开卵泡，用刮刀刮取卵泡壁内层的卵泡颗粒细胞。用PBS将收集的卵泡颗粒细胞清洗3次，然后用台盼蓝鉴定活细胞。

1.4CCK-8测定细胞活性

将收集的卵泡颗粒细胞以每孔1×104个活细胞接种于96孔培养板内。培养液为DMEM/F12，其中含有10%FBS、100 IU/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素以及不同浓度梯度的1α，25-（OH）2D3（0、1、10、100 nM），每孔内含培养液100 μL。每个1α，25-（OH）2D3浓度梯度设定5个复孔，试验重复6次。卵泡颗粒细胞在37℃，5%CO2浓度条件下培养24 h。24 h以后每孔加入10 μLCCK-8溶液，继续培养3 h。3 h后使用酶标仪测定培养板内各孔在450 nm下的吸光度值。

1.5雌二醇测定及细胞计数

将收集的卵巢卵泡颗粒细胞以每孔5×104个活细胞接种于96孔培养板内。培养液组成及1α，25-（OH）2D3浓度梯度同上，每孔内含培养液200 μL。每个1α，25-（OH）2D3浓度梯度设定3个复孔，试验重复6次。卵巢颗粒细胞在37℃、5%CO2浓度条件下培养6 d，期间每48 h换液一次。6 d以后抽取细胞上清液，用牛雌二醇ELISA试剂盒，按其说明书步骤对各样品雌二醇浓度进行测定。吸取上清后，用胰酶消化剩余细胞，将细胞吹散后终止消化，然后用血细胞计数板对各个孔细胞进行计数。

1.6统计分析

所有数据应用SPSS软件进行分析，数据以平均数±标准误表示。方差分析使用单因素方差分析，多重比较采用Duncan法。

2　结果

2.11α，25-（OH）2D3对牛卵泡颗粒细胞活力的影响

牛卵泡颗粒细胞经体外培养24 h后，不同浓度1α，25-（OH）2D3对牛卵泡颗粒细胞活力的影响如图1所示。与不添加1α，25-（OH）2D3的对照组相比，当1α，25-（OH）2D3添加量为1、10、100 nM时，颗粒细胞的活力都有显著提高（P<0.01）。当添加浓度为100 nM时，颗粒细胞的活力最高。

图1　1α，25-（OH）2D3对牛卵巢卵泡颗粒细胞活力的影响

2.21α，25-（OH）2D3对牛卵泡颗粒细胞增殖的影响

牛卵泡颗粒细胞经体外培养6 d后，不同浓度1α，25-（OH）2D3对牛卵泡颗粒细胞增殖的影响如图2所示。与不添加1α，25-（OH）2D3的对照组相比，当1α，25-（OH）2D3添加量为10、100 nM时，颗粒细胞的数目都显著提高（P<0.01），当添加浓度为100 nM时，颗粒细胞的数目最多。

图2　1α，25-（OH）2D3对牛卵巢卵泡颗粒细胞增殖的影响

2.31α，25-（OH）2D3对牛卵泡颗粒细胞雌二醇分泌的影响

牛卵泡颗粒细胞经体外培养6 d后，不同浓度1α，25-（OH）2D3对牛卵泡颗粒细胞雌二醇分泌的影响如图3所示。与不添加1α，25-（OH）2D3的对照组相比，当1α，25-（OH）2D3添加量为10、100 nM时，卵泡颗粒细胞雌二醇分泌显著提高（P<0.01），当添加浓度为10 nM时，颗粒细胞雌二醇分泌量最大。

图3　1α，25-（OH）2D3对牛卵巢卵泡颗粒细胞雌二醇分泌的影响

3　讨论

维生素D是一种脂溶性维生素，属于类固醇激素家族的一员。近年来，维生素D对动物生殖的影响多有报道，但是对母牛生殖的影响未见报道。本研究首次以母牛为研究对象，探寻了维生素D对母牛卵巢卵泡颗粒细胞的影响。卵巢卵泡颗粒细胞是雌性动物至关重要的细胞，因为它是雌激素的主要来源，而雌激素决定了雌性动物的性成熟与生殖。

CCK-8近来广泛用于细胞活力检测［11］，其能与细胞线粒体内脱氢酶进行反应，生成黄色的甲瓚化合物，颜色越深则说明细胞活力越强。本研究用CCK-8证明1α，25-（OH）2D3对卵泡颗粒细胞活力有促进作用。颗粒细胞的活力越强则其增殖与分泌功能也应越强，随后对于颗粒细胞增殖的试验与雌二醇分泌的试验也证实了这一点。不过对于雌二醇而言，1α，25-（OH）2D3对其的最佳刺激浓度并不是100 nM，而是10 nM。这一点不同于细胞活力试验与细胞增殖试验的结果。可能是1α，25-（OH）2D3对雌二醇分泌的调节机制不同于另外两者，因此造成了这样的差异。

1α，25-（OH）2D3对细胞增殖的影响在非生殖细胞内早有研究［12］，本研究也证明了1α，25-（OH）2D3对卵泡颗粒细胞的增殖有促进作用，并且对雌二醇的分泌也有促进作用。牛卵泡发育呈现卵泡波的形式，颗粒细胞增殖与其分泌的雌二醇在卵泡发育中起到至关重要的作用。在同一波的卵泡中，只有优势卵泡才能一直发育并最终排卵，而其它卵泡都不得不闭锁退化掉。而优势卵泡的特点就是颗粒细胞增殖迅速，雌二醇分泌旺盛［13-14］。母牛自出生之日起，其卵巢内卵子数目便不会再增加。但是母牛的卵泡会不停地闭锁退化，导致母牛终生可用的卵子数目不足1%。1α，25-（OH）2D3对母牛卵泡颗粒细胞的增殖及雌二醇的分泌都有促进作用，或许会因此改善母牛的生殖能力，对于这一点还需要继续深入研究。

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Effects of Vitamin D on Follicular Granulose Cells of Cattle Ovarian

Jin Guang，ZhangYuanqing，Xue Yanrong，et al
（Animal Husbandryand VeterinaryInstitute，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan,030000，China）

The objectives of present study were to investigate the effects of bioactive vitamin D（1α，25-（OH）2D3）on cell viability，proliferation and estradiol production of follicular granulose cells of cattle ovarian in vitro.The granulose cells were cultured with different concentrations of1α，25-（OH）2D3，then the cell viabilitywas measured byCCK-8，the cell proliferation was measuredby cell counting and the concentrations of estradiol were measured by ELISA.The results showed that 1α，25-（OH）2D3（1，10，100 nM）enhanced cell viability，100 nM1α，25-（OH）2D3worked best.The results also showed that 1α，25-（OH）2D3（10，100 nM）enhanced cell proliferation and estradiol production.When the concentration of1α，25-（OH）2D3was 100 nM，the stimulation on cell proliferation was the strongest.While the concentration of 1α，25-（OH）2D3was 10 nM，the stimulation on estradiol production was the strongest.

vitamin D；cattle；follicular granulose cell；cell viability；proliferation；estradiol

S823.3

A

2095-3887（2015）03-0019-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.03.006

2015-02-16

山西省研究生创新项目（20133056）

靳光（1981-），男，助理研究员，硕士。

薛艳蓉（1982-），女，助理研究员，硕士。