基于脯氨酸仿生合成的纳米TiO2吸附牛血清白蛋白行为的研究

宫建龙,杨良军,朱龙宝,刘任龙,陶玉贵,梁敏东

(安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000)

基于脯氨酸仿生合成的纳米TiO2吸附牛血清白蛋白行为的研究

宫建龙,杨良军,朱龙宝,刘任龙,陶玉贵,梁敏东

(安徽工程大学生物与化学工程学院,安徽芜湖 241000)

以基于脯氨酸仿生合成的纳米TiO2为吸附剂,研究其对牛血清白蛋白(BSA)的吸附行为,并采用傅立叶变换红外光谱(FT-IR)以及差热-热重分析(DTA-TG)对其界面进行表征．研究结果表明:吸附等温线符合Langmuir吸附模型,为单分子层吸附,最大吸附量为40．1 mg/g,吸附常数为5．71 m L/mg;吸附过程可用Lagergren拟一级动力学方程描述;吸附过程为放热物理吸附．界面表征纳米TiO2与BSA间吸附作用力为氢键和范德华力,与拟合曲线的分析结果相吻合．

纳米二氧化钛;牛血清白蛋白;吸附行为;吸附动力学

仿生合成的纳米TiO2作为一种高新材料[1],除了具有更大的比表面积、尺寸可控特性以及优异的表面效应外,还具有良好的生物相容性和化学稳定性等特点[2-3],在生物医用材料领域研究广泛[4-5]．

目前,纳米TiO2用作生物医用材料,主要集中在材料与蛋白质之间发生吸附的条件研究[6-7],对于材料与蛋白质之间吸附过程中物质与热量的交换研究还有待深入．然而,材料与蛋白质分子之间物质与热量的交换直接影响材料对蛋白质分子的吸附量、吸附速率,热量之间的相互转化将会对吸附类型产生影响,从而进一步影响吸附的自发性[8]．血清白蛋白(BSA)在生物体中起着血液缓冲剂、维持血液渗透压、载运等作用,是人体及动物体内最重要的蛋白之一,常作为研究蛋白质复合材料的模式蛋白．因此,研究BSA与仿生合成纳米TiO2间的吸附行为,对揭示纳米材料与蛋白质之间的相互作用有着一定的意义[9]．

以基于脯氨酸仿生合成的纳米TiO2为吸附剂,通过吸附模型、动力学以及热力学参数等研究仿生纳米TiO2与BSA之间的吸附行为,并辅以FT-IR以及DTA-TG对拟合结果进行验证．

1 材料与方法

1．1 纳米TiO2的仿生合成

依据文献方法[10]将4 mmol脯氨酸溶于蒸馏水中制成溶液,并将无水乙醇缓慢加入溶液中,在强搅拌情况下加入4 m L钛酸正四丁酯,室温搅拌1 h．再将乳白色混合物转入反应釜中,水热反应24 h,抽滤,用无水乙醇、蒸馏水清洗,将得到的沉淀物进行干燥,干燥后放在空气中煅烧3．5 h,得到样品．通过XRD (采用Bruker D8 Advance型X射线衍射仪)、SEM(采用日立S-4800扫描电镜)以及比表面积及孔径(采用美国康塔NOVA 2000e比表面积及孔径分析仪)表征,制备的纳米TiO2为锐钛矿晶型,尺寸为80～150 nm,比表面积为61．42 m2/g,平均孔径为56．36 nm,平均孔体积为0．218 cm3/g．

1．2 载体TiO2吸附BSA

将50 mg的载体TiO2吸附剂放入40 m L的样品瓶中,然后加入25 m L 0．1～1．0 mg/m L BSA(上海金穗生物科技有限公司)溶液,旋紧瓶盖,将样品瓶置于25℃的恒温振荡箱中,振荡搅拌300 min,达到吸附平衡后,离心分离,利用改进型Lowery法蛋白质定量试剂盒(上海近岸科技有限公司,线性范围1．0～1500μg/m L)测定溶液的BSA浓度．

1．3 载体TiO2对BSA的吸附行为

(1)平衡吸附量．平衡吸附量qe(mg/g)由式(1)计算:

式中,c0,ce分别为基质的起始和平衡质量浓度(mg/m L);V为溶液体积(m L);W为吸附剂的质量(g)．

(2)等温吸附线．采用Langmuir吸附模型对实验数据进行拟合,以分析吸附剂的吸附特性,吸附剂的吸附量可由式(2)计算:

式中,qmax最大吸附量(mg/g);Ka为吸附剂的吸附常数(m L/mg)．

(3)吸附动力学．吸附动力学用Lagergren拟一级动力学方程来描述:

式中,qe,q为BSA的平衡时和时间t时的吸附量(mg/g);k为吸附剂的结合速度常数(min－1)．

(4)吸附热力学．采用分批结合实验,由等温吸附线求得结合常数,以ln Ka对1/T作图,采用如式(3)所示Vant＇Hoff方程对数据点拟合,由直线的斜率和截距可求得ΔrHm和ΔrSm．ΔrHm绝对值越大,说明基质与吸附剂的亲和力越强,形成的复合物越稳定;ΔrSm绝对值越大,说明基质与吸附剂形成复合物时构象变化越大．

式中,Ka为BSA在吸附剂的吸附平衡离解常数;ΔrGm、ΔrHm和ΔrSm分别为BSA与吸附剂相互作用的自由能变、焓变和熵变．

1．4 界面表征

吸附了BSA的吸附剂经离心分离,用超纯水和磷酸盐缓冲液进行洗涤,冷冻干燥,利用Prestige-21傅立叶变换红外光谱仪(日本岛津公司)及TGA-2050热分析仪(美国TA-Instruments公司)对界面表征．

2 结果与讨论

2．1 吸附等温线

溶液p H对吸附影响如图1所示．由图1可知,在接近BSA等电点(4．8)时,吸附效果最好,因此吸附实验的BSA溶液都用磷酸盐缓冲液调节为p H值＝5．0．分别以25 mg载体TiO2吸附25 m L初始质量浓度为0．1 mg/m L、0．2 mg/m L、0．3 mg/m L、0．4 mg/m L、0．6 mg/m L、0．8 mg/m L、1．0 mg/m L的BSA溶液．采用式(2)对实验数据进行拟合得图1的吸附等温线,图1中横坐标为不同质量浓度下吸附平衡时的BSA质量浓度,纵坐标为载体TiO2对BSA的结合量．作为对比,采用Freundlich模型对数据进行拟合得图1中的虚线．拟合所得的参数如表1所示．

表1 Langmuir和Freundlich方程参数

采用Langmuir模型所得拟合曲线的相关性R2＞0．999,实验数据与式(2)非常吻合,说明吸附过程为单分子层吸附,BSA饱和吸附量为40．1 mg/g,吸附常数为5．71 m L/mg．饱和吸附量取决于吸附剂的比表面积,吸附常数与吸附剂和BSA分子间的作用力有关．

2．2 吸附动力学

分别以25 mg载体TiO2吸附25 m L初始质量浓度为0．6 mg/m L和1．0 mg/m L的BSA溶液,测吸附时间分别为5 min、10 min、15 min、20 min、40 min、80 min、120 min、160 min、200 min、240 min、300 min的吸附量,按照式(3)对实验数据进行拟合,得到的吸附动力学曲线如图2所示．作为对比,采用拟二级动力学模型对数据进行拟合得图2中虚线．拟合所得的参数如表2所示．

表2 吸附动力学模型参数

采用拟一级动力学模型所得拟合曲线的相关性R2＞0．998,说明纳米TiO2对BSA的吸附行为可用一级动力学模型来描述．由拟二级动力学模型拟合所得的平衡吸附量大于吸附实验的平衡吸附量,这与事实不符,说明吸附过程不能用拟二级动力学模型来描述．纳米TiO2对BSA的吸附过程可分为三步:液膜扩散、孔道扩散和吸附．对于物理吸附,吸附质分子与孔表面的碰撞和定向作用而被吸附几乎是瞬间完成的,因此,吸附速率受前两步扩散控制,通常在吸附初期过程速度受外扩散控制,吸附后期过程速度受内扩散控制．从图2中可以看出,纳米TiO2对BSA的吸附量随着时间的增加而增大．0～120 min内吸附量迅速增加,此为快速吸附过程,由浓度推动力控制颗粒扩散;120～240 min内吸附量增加缓慢,在240 min后吸附量基本不变,达到吸附平衡．纳米TiO2对低质量浓度(0．6 mg/m L)BSA溶液吸附,在160 min时接近吸附平衡,对高质量浓度(1．0 mg/m L)BSA溶液吸附,在200 min时接近吸附平衡,说明在低质量浓度中达到吸附平衡所需时间较短．

2．3 吸附热力学

在298 K、308 K、318 K和328 K温度下,以0．050 g载体TiO2吸附25 m L不同质量浓度的BSA溶液,采用Langmuir吸附模型对所测数据进行拟合,得到不同温度下的吸附等温线如图3所示．求得不同温度下的吸附常数与最大吸附量如表3所示．以1/T为横坐标,ln Ka(m L/mg)为纵坐标作图,拟合所得直线如图4所示．由直线的斜率和截距计算出吸附过程的ΔrHm为－18．7 kJ/mol和ΔrSm为－48．1 J/(mol·K)．

表3 不同温度下纳米TiO2吸附BSA的吸附常数和最大吸附量

从图3和表3可以看出,随着温度的升高,纳米TiO2对BSA的最大吸附量减小,吸附常数(Ka)降低,说明是物理吸附．ΔrHm为负值,吸附过程为放热反应,升高温度,不利于吸附,这与实验结果相一致．|ΔrHm|＜40 kJ/mol表明纳米TiO2与BSA以非共价键相互作用,升高温度,非共价键相互作用减弱,吸附量减小．ΔrSm为负值表明吸附过程中体系的有序性增加．

2．4 吸附界面表征

(1)FT-IR表征．纳米TiO2、BSA以及纳米TiO2-BSA结合物的FT-IR光谱如图5所示．图5a中400～950cm－1有一平而宽的红外吸收带,此吸收峰为Ti-O-Ti吸收峰．3 451．85cm－1的吸收峰是纳米TiO2表面配位的少量水中O－H的伸缩振动峰,而1 632．55cm－1的吸收峰是弯曲振动的结果．图5b中1 653．65cm－1和1 536．82cm－1的特征峰分别处于酰胺Ⅰ带的α-螺旋区域和酰胺Ⅱ带区域．吸收主要是与BSA分子中氨基酸残基的羰基伸缩振动吸收以及与羰基和酰胺的氢形成的氢键有关．图5c中不仅具有Ti-O-Ti吸收峰,也存在BSA特征峰,并且1 653．65cm－1的伸缩振动吸收峰转移到了1 662．72cm－1, 1 536．82cm－1处的N－H弯曲振动吸收峰转移到了1 569．39cm－1,说明吸附剂纳米TiO2与BSA之间通过氢键结合形成吸附层．与热力学结果一致,ΔH＜40 kJ/mol,吸附过程属于物理吸附．

(2)DTA-TG表征．为研究纳米TiO2对BSA的吸附量以及两者结合物的热行为变化,进行了差热-热重法分析．纳米TiO2与BSA结合的DTA-TG曲线如图6所示．样品的重量损失以及热量变化主要有3个阶段:第1阶段在75～150℃之间,图6b中这一段失重是由于吸附中残留的水和醇等挥发所致,图6a中吸热峰的出现是因为水和醇大量气化挥发引起;第2阶段在180～360℃之间,图6b中BSA的燃烧和分解导致了失重的发生,质量损失4．34%,而表1纳米TiO2对BSA的吸附量为40．1 mg/g,占质量的4.01%,与第2阶段质量损失基本相同．图6a中出现的吸热峰表明纳米TiO2脱附BSA需要吸收热量,与热力学结果中纳米TiO2吸附BSA释放热量吻合;第3阶段在480～680℃之间,图6a中吸热峰的出现是由于纳米TiO2由低温变体向高温变体的晶型转变所引起,图6b中伴随的失重是因为表面基团消散所致．

3 结论

以基于脯氨酸仿生合成的纳米TiO2吸附剂对BSA具有较好的吸附性能．纳米TiO2吸附BSA为单分子层物理吸附,符合Langmuir模型．吸附过程受吸附质浓度控制,可用Lagergren拟一级动力学来描述．吸附过程为放热,混乱度减小,分子有序性增加．通过FT-IR和DTA-TG对纳米TiO2-BSA结合物的表征,进一步验证了上述结论．为进一步研究仿生纳米TiO2对蛋白质有机大分子吸附过程中物质传输及热量交换等方面提供了依据．

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The adsorption behavior of Bovine Serum Albumin onto Nano-TiO2biomimetic synthesis based on proline and bovine serum albumin

GONG Jian-long,YANG Liang-jun,ZHU Long-bao, LIU Ren-long,TAO Yu-gui,LIANG Min-dong
(College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

The adsorption behavior of bovine serum albumin(BSA)onto Nano-TiO2biomimetic synthesis based on Proline was investigated．Fourier transform infrared spectrophotometry(FT-IR)and Differential Thermal Analysis-Thermal Gravimetry(DTA-TG)were employed to interface characterization．The results showed that fitting curve of isotherm adsorption accorded with Langmuir adsorption model,and the adsorption was monomolecular layer adsorption,and the maximum adsorption capacity was 40．1 mg/g and adsorption constant was 5．71 m L/mg．the adsorption process can be described by Lagergren pseudo-first-order kinetic model,belonging to an exothermic physical adsorption．Interface characterization showed that the interaction between Nano-TiO2and BSA was hydrogen bond and Vander Waals which conforms to the results of analysis of fitting curves．

Nano-TiO2;bovine serum albumin;adsorption behavior;adsorption kinetics

O614．41

A

1672-2477(2015)04-0007-05

2015-04-01

安徽省自然科学基金资助项目(1308085MC51);安徽省高校自然科学基金资助项目(KJ2012A034);安徽省高校青年科研基金资助项目(2003JQL370);国家级大学生创新创业训练计划基金资助项目(201410363023)

宫建龙(1969-),男,安徽含山人,讲师,博士．