荷丹片对APOE-/-小鼠炎症因子及氧化应激因子的影响

2015-11-24于柏青周玉娟刘福林曹晓华许明轩

天津医药 2015年10期

于柏青，周玉娟，刘福林，曹晓华，许明轩

于柏青1，周玉娟2△，刘福林3，曹晓华3，许明轩4

目的探讨荷丹片对载脂蛋白E基因敲除（APOE-/-）小鼠炎症因子、氧化应激因子的影响及对动脉粥样硬化（AS）的干预作用及机制。方法将50只APOE-/-小鼠随机均分为对照组、模型组、荷丹片低剂量组、荷丹片高剂量组及辛伐他汀组。对照组给予普通饲料，其余组给予高胆固醇饲料造模。同时用药组灌胃相应剂量药物，对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃。造模12周后测定血清白细胞介素（IL）-1、IL-10、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平；RT-PCR测主动脉肿瘤坏死因子（TNF）-α mRNA表达。结果模型组较对照组IL-1、MDA、TNF-α mRNA升高，IL-10、SOD降低（P＜0.01）；荷丹片低剂量组、荷丹片高剂量组、辛伐他汀组较模型组IL-1、MDA、TNF-α mRNA降低，IL-10、SOD升高（P＜0.01）。结论荷丹片可通过抗炎、抗氧化应激作用干预AS的发生、发展。

动脉粥样硬化；载脂蛋白E类；模型,动物；荷丹片；APOE-/-小鼠；炎症因子；氧化应激因子

动脉粥样硬化（AS）是全球发病率和病死率最高的疾病［1］。目前临床对于AS的治疗以西药为主，但不良反应明显，且患者依从性差。荷丹片是复方调脂中药，具有升清降浊、化痰祛瘀功效。本研究旨在观察荷丹片对载脂蛋白E基因敲除（APOE-/-）小鼠炎症因子白细胞介素（IL）-1、IL-10、肿瘤坏死因子（TNF）-α及氧化应激因子丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的影响，以探讨荷丹片对AS的干预作用及其机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料（1）动物。健康清洁级APOE-/-小鼠（C57BL/6J背景）50只，雌雄各半，8周龄，平均体质量（18.46±1.66）g，合格证编号为SCXK（京）2013-0002，购自中

国医学科学院医学实验动物研究所，饲养于河北大学医学部动物实验中心。（2）药物和试剂。荷丹片（南昌济顺制药有限公司），辛伐他汀片（山东方明药业集团股份有限公司），胆固醇（赛尔克生物公司），IL-1、IL-10、MDA、SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司），TRizol RNA抽提试剂（Am⁃bion公司），反转录试剂盒（Promega公司），PCR引物（上海生工）。（3）实验仪器。TDL-5-A离心机（上海安亭科学仪器厂），Model680酶标仪（美国BIO-RAD公司），HWS型智能恒温恒湿箱（宁波东南仪器有限公司），全自动凝胶成像仪（中国容智创业，ChampGel 5000），普通PCR仪（Applied Biosys⁃tems公司）。

1.2 模型制备50只APOE-/-小鼠随机数字表法均分为对照组、模型组、荷丹片低剂量组、荷丹片高剂量组及辛伐他汀组。适应性喂养1周后，对照组正常饮食，其余组予1.25%胆固醇高胆固醇繁殖饲料喂养［2］以建立AS模型。造模开始同时荷丹片低、高剂量组分别给予0.65、2.60 g·kg-1·d-1荷丹片灌胃，辛伐他汀组6 mg·kg-1·d-1辛伐他汀灌胃。对照组、模型组每日等量生理盐水灌胃，每周称体质量调整剂量，共灌胃12周。12周末，待小鼠空腹12 h后处死，摘眼球取血，离心分离血清，-20℃保存。分离主动脉，置于液氮中保存。

1.3 检测项目及方法严格按照试剂盒说明书进行操作。ELISA法测定血清IL-1、IL-10水平，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力。按TRizol试剂说明书提取组织总RNA，进行逆转录，严格按照试剂盒说明进行操作。逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测：取上述互补脱氧核苷酸（cDNA）产物进行聚合酶链式反应扩增。TNF-α引物（374 bp）：上游5′-CCTGTAGCCCACGTCG⁃TAGC-3′，下游5′-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3′。β-ac⁃tin（173 bp）:上游5′-AAATCGTGCGTGACATCAAA-3′，下游5′-AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC-3′，反应条件参考文献［3］。RT-PCR反应产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳。以β-actin为内参，荷丹片对TNF-α mRNA表达的影响采用目的基因扩增片段的灰度值与β-actin扩增片段的灰度值的比值表示。

1.4 统计学方法采用SPSS 16.0软件进行统计学处理。符合正态分布的计量资料以表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较，方差齐采用LSD-t法，方差不齐采用Dunnett T3方法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荷丹片对APOE-/-小鼠血清IL-1、IL-10的影响模型组较对照组IL-1水平升高，IL-10水平降低，荷丹片低剂量组、荷丹片高剂量组、辛伐他汀组较模型组IL-1水平降低，IL-10水平升高（P＜0.01）。荷丹片低剂量组的IL-1水平高于辛伐他汀组（P＜0.01），IL-10水平差异无统计学意义（P＞0.05）；荷丹片高剂量组与辛伐他汀组的IL-1、IL-10水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 荷丹片对APOE-/-小鼠血清MDA、SOD的影响模型组较对照组MDA升高，SOD降低（P＜ 0.01）；荷丹片低剂量组、荷丹片高剂量组、辛伐他汀组较模型组的MDA降低，SOD升高（P＜0.01）。荷丹片低剂量组的MDA高于辛伐他汀组，SOD低于辛伐他汀组（P＜0.01）；荷丹片高剂量组与辛伐他汀组的MDA、SOD水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

Tab.1Effects of Hedan tablet on serum levels of IL-1 and IL-10 in APOE-/-mouse表1 荷丹片对APOE-/-小鼠血清IL-1、IL-10的影响（n=10，ng/L,）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与模型组比较，c与荷丹片低剂量组比较，P＜0.01；表2同

IL-10 33.79±2.35 26.44±2.68a31.99±2.81b34.28±3.20b33.05±2.78b13.07＊＊组别对照组模型组荷丹片低剂量组荷丹片高剂量组辛伐他汀组F IL-1 116.82±8.06 207.85±11.43a161.63±9.64b121.18±8.08b115.48±7.55bc196.52＊＊

Tab.2Effects of Hedan tablet on serum levels of MDAand SOD in APOE-/-mouse表2 荷丹片对APOE-/-小鼠血清MDA、SOD的影响（n=10,）

组别对照组模型组荷丹片低剂量组荷丹片高剂量组辛伐他汀组F MDA（μmol/L）37.00±4.07 52.02±7.05a41.00±3.77b36.02±4.06b33.30±4.02bc23.79＊＊SOD（U/mL）98.08±5.28 86.58±3.62a94.92±5.69b98.59±4.10b100.18±4.63bc13.21＊＊

2.3 荷丹片对APOE-/-小鼠主动脉组织TNF-α mRNA表达的影响对照组、模型组、荷丹片低剂量组、荷丹片高剂量组、辛伐他汀组TNF-α mRNA表达量分别为0.27±0.04、0.58±0.06、0.36±0.05、0.25± 0.04及0.21±0.04（F=89.92，P＜0.05），其中模型组较对照组升高（P＜0.01），荷丹片低剂量组、荷丹片高剂量组、辛伐他汀组较模型组降低（P＜0.01）；荷丹片低剂量组较辛伐他汀组升高（P＜0.01），但荷丹片高剂量组与辛伐他汀组差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

Fig.1Transcription level of TNF-α mRNA图1 各组TNF-α mRNA表达

3 讨论

中医理论认为，AS属于本虚标实之血瘀、痰浊的范畴，治疗上有祛痰降浊、活血化瘀、补益肝肾等方法。荷丹片是一种将荷叶、丹参、补骨脂、潘泻叶及山楂配伍组方的新型调脂中药。AS的病因尚未完全明确。研究显示，炎症是AS早期形成的重要诱因，由炎症介导的脂质代谢异常是AS的关键环节［4］。炎症反应参与AS发生、发展的全过程，并被看作是AS的有效治疗靶点［5］。

IL-1是参与AS过程的典型的促炎细胞因子，可促进黏附分子的表达，增加肝脏急相反应蛋白的合成。IL-10可以抑制炎性细胞的激活、黏附和浸润，抑制Th1淋巴细胞分泌干扰素（IFN）-γ、TNF-α等细胞因子。前期研究证实，荷丹片可以通过调脂作用干预APOE-/-小鼠AS［6］。本研究结果显示，荷丹片低、高剂量组、辛伐他汀组较模型组IL-1水平降低、IL-10水平升高，提示荷丹片可通过下调APOE-/-小鼠血清促炎性细胞因子IL-1水平，同时上调IL-10水平来发挥抗炎作用。

TNF-α能激活核因子（NF）-κB信号通路，诱导黏附分子的表达，促进单核细胞聚集浸润［7］。通常情况下，TNF-α可增强低密度脂蛋白（LDL）与内皮细胞的黏附结合，可阻断脂蛋白酯酶而导致高三酰甘油血症，减少脂肪酸的氧化，促进氧自由基的产生。本研究结果显示，荷丹片低、高剂量组、辛伐他汀组较模型组TNF-α水平降低，提示荷丹片可以通过降低TNF-α水平来减轻炎症反应，与况军等［8］研究认为的荷叶碱降低小鼠AS血管炎症的结果一致。因此，笔者推测荷丹片可以通过其君药荷叶的主要活性成分荷叶碱［9］来降低炎症反应，干预AS的发生发展。

氧化应激反应增强对细胞和生物大分子产生毒性反应，诱导细胞凋亡、坏死，并可能导致促炎性细胞因子生成增多，进而引发病变，加快AS的进展［10］。体内MDA的含量可反映机体内脂质过氧化反应的程度已得到临床共识［11］。本研究结果显示，荷丹片低、高剂量组、辛伐他汀组较模型组MDA降低，SOD升高，表明荷丹片可以通过降低MDA水平、升高SOD水平来抑制氧化应激反应。SOD是存在于胞浆和线粒体中清除氧自由基的关键酶，可保护机体不受氧自由基损伤，因此，笔者认为测定SOD的活性可反映出机体抗氧化的能力。综上所述，荷丹片可以降低炎症反应、减轻氧化应激状态、抑制单核细胞聚集、保护血管内皮细胞，从而干预AS的发生发展，为AS的临床防治提供了广阔的应用前景。

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（2015-01-28收稿 2015-03-31修回）

（本文编辑陆荣展）

Effects of Hedan tablet on cytokins and oxidative stress factors in APOE-/-mouse

YU Baiqing1,ZHOU Yujuan2△,LIU Fulin3,CAO Xiaohua3,XU Mingxuan4
1 Graduate College，Hebei University，Baoding 071000，China；2 Basic Medical College，Hebei University；3 Affiliated Hospital of Hebei University；4 the People′s Hospital of Cangzhou△

ObjectiveTo observe the effects of Hedan tablet on cytokines and oxidation factors in APOE-/-mouse,and to explore its effect on atherosclerosis and to explore its behind mechanism.MethodsAPOE-/-mice（n=50）were randomly divided into control group,model group,low dose Hedan tablet treatment group,high dose Hedan tablet treatment group and simvastatin treatment group.Mice in control group were given normal feed while mice in other groups were fed with high cho⁃lesterol diet.Hedan or Simvastatin was administrated intra-gastrically while normal saline was given to model group in the same route.After 12 weeks,mice were sacrificed to observe the mRNA level of tumor necrosis factor-α（TNF-α mRNA）in aorta by RT-PCR.Mean while,serum levels of interleukin-1（IL-1）,interleukin-10（IL-10）,malonaldehyde（MDA）and su⁃peroxide dismutase（SOD）were determined in different groups.ResultsCompared with control group,TNF-α mRNA tran⁃scription level as well as serum levels of IL-1 and MDA significantly increase while serum levels of IL-10 and SOD de⁃creased remarkably in model group,（P＜0.01）.Compared with model group,mRNA levels of TNF-α as well as serum levels of IL-1 and MDA were significantly decreased while serum levels of IL-10,SOD were greatly increased in low dose and high dose Hedan tablet treatment groups as well as in simvastatin treatment group（P＜0.01）.ConclusionHedan tablet inhibit the formation of atherosclerosis through its anti-oxidation role and anti-inflammation role.

atherosclerosis；apolipoproteins E；models,animal；Hedan tablet；atherosclerosis；APOE-/-mouse；inflam⁃mation factor；oxidation stress factor

R972.6；R394.114

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.016

河北大学医学学科专项基金建设项目（2012A3001）

1河北保定，河北大学研究生院（邮编071000）；2基础医学院药理教研室；3河北大学附属医院；4沧州市人民医院

于柏青（1990），女，硕士在读，主要从事心血管药理学研究

△通讯作者E-mail:zyj@hbu.edu.cn