小鼠原位气管移植模型手术技巧及改良

王欣，董明，陈兴隆，李光△

小鼠原位气管移植模型手术技巧及改良

王欣1，董明2，陈兴隆3，李光3△

目的探讨改良原位气管移植模型的手术方法以提高生存率，减少手术时间。方法清洁级C57BL/6（供体）和BALB/c（受体）小鼠各30只，依体质量相近配对并随机分为3组。采用“经口插管气道内支架”吻合，原位气管移植建立动物模型，并记录手术时间。术后观察实验动物生存期及一般状况，并分别于术后15、30及60 d各处死10只，取出气管，HE染色观察移植气管的组织病理变化，计算气管阻塞率。结果受体小鼠均存活至取气管时，手术时间：供体气管摘除（7.0±1.0）min，受体气管摘除（7.0±1.0）min，经口插入套管（1.0±0.5）min，供体气管吻合（20.0± 4.0）min，手术总时间（43.0±10.0）min。移植后气管淋巴细胞及中性粒细胞浸润，气管阻塞率于15、30及60 d逐渐增加，符合闭塞性细支气管炎病理特点。结论经口插管气道内支架吻合法建立小鼠原位气管移植模型操作简便，手术技巧和设备要求低，手术成功率高。不需要专业的外科技巧及手术设备。

肺移植；细支气管炎,闭塞性；疾病模型,动物；小鼠,近交C57BL；小鼠,近交BALB C

在肺移植手术的预后中，闭塞性细支气管炎（obliterative bronchiolitis，OB）的5年和10年发生率可分别在50%和75%左右［1］。闭塞性细支气管炎的发病机制目前仍不清楚。其研究模型主要有异位和原位气管移植。相比较于异位气管移植，原位气管移植更能模拟出肺通气与换气的过程，但操作难度更大，模型的成活率较低［2］。本研究旨在探讨原位气管移植改良方法，以期为肺移植的基础研究提供模型选择。

1 资料与方法

1.1 一般资料清洁级C57BL/6和BALB/c雌性小鼠各30

只（天津医科大学实验动物中心），体质量25～30 g。C57BL/ 6小鼠作为供体组，BALB/c小鼠作为受体组，2组相近体质量配对成30对后随机分成3个配对组，每组10只，供、受体均为清洁手术，术前不禁食水，2%水合氯醛腹膜内注射麻醉，缝合采用9-0尼龙缝线（上海精仪医疗器械厂），单人操作。受体组术后灯照保暖3 h，禁食水6 h，分别于术后15、30、60 d处死10只。

1.2 原位气管移植（1）供体手术。水合氯醛0.1 mg/g腹膜腔注射麻醉，仰卧位，固定于手术台。取小鼠的颈前正中切口。游离气管，截取出4～6个软骨环长度气管，见图1A。在尾端12点位置用9-0带针缝合丝穿过，用以标记方向和提拉气管。将取出的气管置于4℃的生理盐水中冲洗存放。修剪供体气管，去除周围组织，保留至少4个气管软骨环长度气管备用。（2）受体手术。麻醉固定后，22G套管应用Das法［3］经口插入受体小鼠气管,解剖游离受体气管,见图1B。取环状软骨下第6个气管环处切开气管，但不切断，延切口处伸出22G气管内套管，插入供体气管，并用供体气管尾部预留9-0缝线与受体尾端气管12点处缝合不打结。完全切断气管，将气管内套管插入供体气管及受体下端气管，移植气管12点缝合处对位打结。于尾端吻合口4点、8点处缝合打结。同时按上述方法吻合头侧气管。缝合肌肉及皮肤。经气管内套管负压吸引，清理气管，拔出套管。

Fig.1Orotracheal intubation图1 经口气管插管

1.3 手术时间及存活情况记录以下各个阶段完成时间：（1）供体气管摘除时间。（2）受体气管分离时间。（3）经口插入套管时间。（4）供体气管吻合时间。（5）手术总时间。观察实验动物术后生存期的体质量和呼吸音变化。

1.4 病理学特征受体小鼠分别在第15、30、60天时处死10只，常规解剖取出气管，观察移植气管局部解剖特征。常规石蜡包埋，4 μm切片，HE染色后光镜（×100）下观察。

1.5 气管阻塞率测定在移植气管的中段平均取5个断面，每个断面估算阻塞的百分率，阻塞百分率=阻塞面积r2/气管面积R2（r、R分别为阻塞和气管的半径），取5个断面阻塞百分率的平均值作为该气管的阻塞率。

2 结果

2.1 手术时间及存活情况手术操作过程中无小鼠死亡，术后小鼠模型的存活率100%，手术操作时间：供体气管平均摘除时间为（7.0±1.0）min，受体气管平均分离时间（7.0±1.0）min，经口插入套管平均（1.0±0.5）min,供体气管吻合平均（20.0±4.0）min，手术总时间平均（43.0±10.0）min。受体小鼠术后出现呼吸急促，哮鸣音，8～9 d后略有缓解。但至预杀期症状持续存在。术后第15、30、60天存活小鼠体质量为（28.0±2.0）g，无明显变化。

2.2 病理学特征处死小鼠后，可见周围覆被的肌肉组织同移植气管紧密相连，有血管长入移植气管。移植后15 d镜下可见气管上皮较完整，黏膜下层淋巴细胞浸润较少，软骨形态较完整，少量坏死；30 d可见移植气管上皮脱落坏死，少许鳞状上皮覆盖吻合口，黏膜下大量淋巴细胞及中性粒细胞浸润，软骨细胞坏死；60 d可见移植气管上皮大量脱落坏死，鳞状上皮覆盖吻合口，黏膜下大量淋巴细胞及中性粒细胞浸润，气管管腔严重阻塞，软骨细胞坏死，部分软骨中间部正常结构不能分辨，见图2。

Fig.2Histological features of allografts on D 15,30 and 60 after transplantation（HE，×100）图2 各时点移植气管光镜下病理情况观察（HE，×100）

2.3 气管阻塞率移植气管管腔逐渐闭塞。移植后15、30及60 d的气管阻塞率分别为（26.4± 3.7）%、（39.6±4.1）%及（45.3±3.2）%。

3 讨论

在早期研究闭塞性细支气管炎时，曾采用异位气管移植的方法，但此法移植气管无通气换气功能，

不符合人体肺移植后气管的生理需求［4］。原位气管移植模型可解决此问题，可以模拟出人体在肺移植后发生闭塞性细支气管炎的症状。但是小鼠原位气管移植模型由于实验动物体型较小，需要较高的手术操作技巧以及精密的手术仪器，建模有一定困难；而大型动物原位气管移植操作虽然简单，但是成本较高［5］。

Genden等［6］2002年首次建立小鼠的原位气管移植模型，但模型建立过程需要手术显微镜，对器械及手术熟练度要求也较高。本研究组前期应用Genden法建立动物模型，死亡率较高，考虑死亡主要原因:一是在气管吻合过程中，周围组织渗出液误吸入气道，导致窒息；其次，由于移植气管吻合对位不良，易导致气道扭转移位造成实验动物死亡。本研究对其手术方法进行了改良，应用气管内插入套管保证气道通畅，便于清理气道，防止误吸；同时形成骨性支架，方便吻合，先于供体气管和受体气管。在尾端12点缝合定位，以防止吻合后对位不良，气道扭转。同时，此法手术时间短，平均为（43.0±10.0）min，术后小鼠均存活至预杀期，有较高手术存活率，可以为下一步实验提供良好的模型保障。

临床上的闭塞性细支气管炎模型主要表现为细支气管黏膜周围有大量的中性粒细胞以及淋巴细胞浸润，管腔内有肉芽组织增生导致的狭窄阻塞［7］。本研究病理观察显示，随着时间推移，移植气管上皮逐渐脱落坏死，鳞状上皮覆盖吻合口，黏膜下淋巴细胞及中性粒细胞浸润，气管管腔阻塞，气管阻塞率逐渐增加，符合闭塞性细支气管炎病理学特点。同时，与异位气管移植模型比较，此种移植方式使移植气管具备通气功能，更加符合生理特点［8］。移植气管的血液供应是气管存活的重要条件，以往人们采用大网膜包绕、肌瓣包绕等［9］方法解决移植后气管的血供问题。本研究在移植后直接用颈部肌肉和腺体包绕气管，移植后气管大量鳞状上皮覆盖吻合口，气管内炎性细胞浸润，移植后小鼠均存活至预杀期，表明移植气管存活良好。小鼠解剖过程中可见周围覆被的肌肉组织同移植气管紧密相连，有血管长入移植气管，考虑可能与小鼠自身再生能力较强有关。

综上所述，本研究新建的气管移植模型，不需要使用手术显微镜和微创外科器材等特殊昂贵的手术器材，术者也无需进行专业的手术操作训练，手术操作时间短，可获得较高的模型存活率，为下步实验提供稳定的模型保障。同时，实验动物保存了通畅的气管，与人体肺移植后气管生理功能相符，移植术后产生与闭塞性细支气管炎相似的病理改变，实验动物均可长期存活，为后续的研究提供了保证，具有一定的实用价值。

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（2015-02-12收稿 2015-03-31修回）

（本文编辑 陆荣展）

Technique improvement in establishing mice orthotopic tracheal transplantation surgery model

WANG Xin1，DONG Ming2，CHEN Xinglong3，LI Guang3△
1 Department of Pediatric Surgery，Tianjin Children′s Hospital，Tianjin 300134，China；2 Department of Lung Cancer Surgery，Tianjin Medical University General Hospital；3 Basic Medical College，Tianjin Medical University△

ObjectiveTo explore a simple and effective way of establishing a mice orthotopic tracheal transplantation model in studying bronchiolitis obliterans to reduce operation time.MethodsTracheas from C57BL/6 mice（n=30）were im⁃planted into Balb/c mice（n=30）.Grafts and hosts were matched according to body weight."Orotracheal intubation and endostent"was used for trachea anastomose and animal model was establish.Operating time was also noted.Grafts were harvest⁃ed on Days 15,30 and 60 after transplantation,using HE staining to observe pathological changes of allograft.Trachea block⁃ing rate was also calculated.ResultsUntil survival of trachea transplantation,the operative time of donor′s and the recipi⁃ent′tracheas resection were（7.0±1.0）min and（7.0±1.0）min respectively."Orotracheal intubation the endo-stent"establish⁃ment cost（1±0.5）min.Trachea anastomose took（20.0±4.0）min and the operation time last（43.0±10.0）min.Conclusion The improvement of orthotopic tracheas transplantation using"Orotracheal intubation the endo-sten"for trachea anastomose is esay-operated and did required complicate skills and instruments with high successful rate.So it is an ideal and stable model in studying bronchiolitis obliterans.

lung transplantation；bronchiolitis obliterans；disease models,animal；mice,inbred C57BL；mice,inbred BALB/C

R655.3；R617

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.010

国家“863”高技术研究发展计划资助项目（2012AA021003）；天津市卫生局科技基金资助项目（2014KZ127）

1天津市儿童医院儿外科（邮编300134）；2天津医科大学总医院肺部肿瘤外科；3天津医科大学基础医学院

王欣（1983），女，主治医师，硕士，主要从事小儿外科及相关基础研究

△通讯作者E-mail：lgtijmu@163.com