三唑酮及其代谢物在烟叶中的降解规律

李义强，杨立强,，刘万峰，徐光军，孙建宏，曹守涛，高云，徐金丽，郑晓

1中国农业科学院烟草研究所/国家烟草专卖局病虫害监控与综防重点实验室，山东青岛 266101；2山东中烟工业有限责任公司，山东济南 250100；3湖南中烟工业有限责任公司，湖南长沙 471000

植物保护

三唑酮及其代谢物在烟叶中的降解规律

李义强1，杨立强1,2，刘万峰3，徐光军1，孙建宏2，曹守涛2，高云2，徐金丽1，郑晓1

1中国农业科学院烟草研究所/国家烟草专卖局病虫害监控与综防重点实验室，山东青岛 266101；2山东中烟工业有限责任公司，山东济南 250100；3湖南中烟工业有限责任公司，湖南长沙 471000

为制定烟叶中三唑酮及代谢产物的农药残留限量，研究了合理使用条件下，三唑酮及其代谢物三唑醇在烟叶中残留降解规律和残留水平。采用气相色谱电子捕获检测器（GC-ECD）建立了同时测定烟叶中三唑酮和代谢产物三唑醇农药残留的检测方法，结果表明：三唑酮在鲜烟叶和烤后烟叶中的最低检出量（LOQ）分别为0.01、0.05 mg/kg。三唑酮、三唑醇在鲜烟叶和干烟叶样品中添加水平为0.01～ 5 mg/kg时，平均添加回收率为79.8%～97.3%，RSD为1.5%～9.0%，符合农药残留检测方法要求。对2011-2012年山东、湖南两地三唑酮残留试验的烟叶样品进行了检测。结果表明，三唑酮在自然生长条件下半衰期为3.8～5.6 d，在储存条件下的半衰期分别为157～315 d。最终残留试验结果表明，施药剂量和采收安全间隔期与烟叶中农药残留量显著相关，末次施药后7、14、21 d，烤后烟叶中三唑酮及代谢物的残留量分别为0.33～6.44 mg/kg、0.15～2.77 mg/kg、0.18～2.53 mg/kg。建议三唑酮及代谢产物在烟叶中MRL为5mg/kg，安全间隔期（PHI）为14 d。

三唑酮；三唑醇；烟叶； 农药残留；降解

三唑酮是高效、广谱、内吸性三唑类低毒杀菌剂。其作用机理是药剂被植物体各部分吸收后，在植物体内传导，通过抑制菌体麦角甾醇的生物合成，抑制或干扰菌丝生长和孢子形成，从而达到防治病害的目的。兼有保护、治疗、铲除和熏蒸等作用，广泛用于农作物白粉病、锈病防治[1]。近几年，随着我国烟区气候条件变化，烟草白粉病由以前的次要病害上升为烟草主要病害种类[2]，并且在西南烟区发生较严重。不少烟区把三唑酮作为防治烟草白粉病的首选药剂，导致部分产地烟叶中三唑酮检出率偏高，对烟叶出口贸易和国内烟叶质量安全造成了影响。目前我国颁布的“食品中农药最大残留限量（GB 2763-2014）”将三唑酮的残留定义为三唑酮母体与代谢物三唑醇的总和，以三唑酮计。目前三唑酮及其代谢物三唑醇的标准检测有“植物性食品中三唑酮残留量的测定（GB/T 5009.126）”和“蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定（NY/T 761）”等标准方法[3-4]。国内相关学者开展金银花、甘蓝等农产品和土壤中三唑酮残留检测方法研究的文献报道[5-12]，但关于烟草中三唑酮和三唑醇检测方法未见报道。在此背景下，本文建立了烟叶中三唑醇及其代谢物三唑酮的残留检测方法，并开展了残留田间试验，对三唑酮及代谢物三唑醇在烟叶中的农药残留特征及降解规律进行研究，为三唑酮在烟草上的合理使用及烟叶中三唑酮残留限量的制定提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验农药：25%三唑酮可湿性粉剂，四川化工研究院生产。乙腈（HPLC级）、丙酮（HPLC级）、正己烷（HPLC级）。氯化钠（AR）。无水硫酸钠（AR），600 ℃烘5 hr，充分冷却后使用。三唑酮标准品（99.0%）、三唑醇标准品（98.5%），德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司购买。

1.2 试验设计

1.2.1 不同因子对烟叶中残留量影响的田间试验

试验分别于2011-2012年在山东省青岛市和湖南省长沙市2地进行。试验地肥力中等，生产过程和田间管理按照GAP烟叶生产操作规程执行。25%三唑酮可湿性粉剂防治烟草白粉病，推荐施药剂量：112.5-150 g a.i./hm2。根据“农药残留试验准则（NY/T 788-2004）”要求，设计试验，每个小区面积30 m2，重复3次，小区间设保护行。另设不施药对照小区。

处理Ⅰ：消解动态 烟草旺长后期，烟草植株全株喷雾施药，施药量225 g a.i./hm2，用水量900 kg/hm2。分别于施药后 1h、1、3、5、7、14、21、28、35、42d采集上中下部位烟叶，每次烟叶采样不少于50片，切碎混匀，四分法留样300g，-20℃保存。

处理Ⅱ：低量3次施药 旺长后期-采收期施药3次，施药量150 g a.i./hm2，用水量900 kg/hm2，每次间隔7d。分别于末次施药后7、14、21d随机采收烟叶，每小区不少于100片，按照常规三段式烘烤。烤后烟叶去主脉切碎、缩分，留样约200g，-20℃保存。

处理Ⅲ：低量2次施药 施药2次，其余同处理Ⅱ。

处理Ⅳ：高量3次施药 施药量225 g a.i./hm2，其余同处理Ⅱ。

处理Ⅴ：高量2次施药 施药量为225 g a.i./hm2，施药次数为2次，其余同处理Ⅱ。

处理Ⅵ：不施药 与上述5个施药处理同步采集样品，-20℃低温保存。

1.2.2 烟叶残留储存降解试验

选用经过检测确认不含三唑酮农药的烟丝样品，添加不同浓度的农药混合标准溶液，添加浓度分别为2 mg/kg和10 mg/kg，并充分混匀，保证农药残留在样品中的均匀性，同时设置空白对照。将烟丝盛装于3个纸箱中，在山东青岛正常温湿度环境和恒温恒湿条件下（温度20 ℃，湿度63%）分别储存。在0、7、30、60、90、120、180、240、300、360 d 取 样， 并对农药残留量进行检测。

1.3 残留测定

1.3.1 仪器、试剂与标准品

Agilent 7890 A气相色谱仪（电子捕获检测器）。

色谱柱：熔融毛细管柱DB-1（30 m×0.32 mm×0.25 μm）。

千分之一电子天平，SHIMADZU-UW420 H。

万分之一电子天平，ER-182 A。

回旋式震荡器，BLUD PARD WSZ-200 A。

超声波提取器，RSQ-60 AS。

旋转蒸发仪，HEIDOLPH-ADVANTAGE。

1.3.2测定方法

关于三唑酮和三唑醇的残留测定方法，笔者参考了标准方法，结合相关文献内容，通过重复试验改进，建立了烟草中农药残留检测方法：称取鲜烟叶20.0 g（或干烟叶4.0 g，加适量水浸润），静置15 min，加80 mL乙腈，回旋式振荡器振荡提取1 h，加10 g氯化钠，震荡10 min，过滤，无水硫酸钠除水后取20 mL，旋转蒸发（50 ℃）减压浓缩至近干，用2 mL淋洗液溶解残渣，转移到预先用5 mL丙酮/正己烷（1:9，V/V）淋洗液预淋的层析柱中（Cleanert Florisil-SPE柱，1 g/6 mL），用15 mL淋洗液淋洗，收集淋出液，40 ℃旋转蒸发减压浓缩至近干，用2 mL淋洗液溶解，过0.45μm滤膜，待测定。

1.3.3 色谱条件

检测条件：进样口温度230 ℃，检测器温度300 ℃，程序升温。柱温升温过程：初始温度150 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。在此条件下，检测目标物相对保留时间：三唑酮11.7 min、三唑醇13.1 min。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 22.0进行单因变量与多个自变量随机区组分析，在p＜0.05范围内，p值越小，相关性越高；采用excel软件中的一级动力学方程计算半衰期和消解速率，R2越接近1，相关性越高。

2 结果与分析

2.1 标准工作曲线与最小检出量

以100 mg/L的三唑酮、三唑醇标准品母液，配 制 成 浓 度 分 别 为 0.02、0.1、1.0、2.0、5.0 mg/L的标准曲线工作液，以进样量（ng）为横坐标，对应气相色谱测定峰面积为纵坐标绘制标准曲线。三唑酮一元线性回归方程为y=96859x-4199.4，相关系数为r=0.9992；三唑醇一元线性回归方程为y=5899.9x+619.5，相关系数为r=0.9983。通过3倍噪音计算目标农药的最小检出量（LOD）为3×10-11g。通过添加确认，三唑酮和三唑醇在不同介质中的最低检出浓度（LOQ）分别为：鲜烟叶为0.01 mg/kg，干烟叶为0.05mg/kg。

2.2 添加回收率试验

鲜烟叶、干烟叶空白样品，分别添加3个不同浓度的三唑酮、三唑醇标准品溶液，每个浓度重复5次，按上述方法提取、净化和检测。结果表明，在鲜烟叶中添加浓度为0.01、0.5、5.0 mg/kg时，三唑酮平均回收率为91.5%～97.3%，RSD为3.0%～4.6%；三唑醇平均回收率为79.8%～96.7%，RSD为1.5%～8.0%；在干烟叶中添加浓度为0.05、0.5、5.0 mg/kg时，三唑酮平均回收率为83.2%～91.7%，RSD为2.1%～9.0%，三唑醇平均回收率为84.2%～86.7%，RSD为4.2%～9.0%。回收率和相对标准偏差（RSD）均符合农药残留试验的要求。

2.3 三唑酮及代谢产物在烟叶中消解动态残留试验结果

25%三唑酮可湿性粉剂在烟叶中消解动态试验结果表明。以225 g a.i./hm2施药1次，山东、湖南2年2地烟叶样品中，三唑酮在施药后1 h原始沉积量9.42～23.4 mg/kg，3 d时，消解率超过50%，14 d时消解率全部超过90%；理论半衰期3.8～5.6 d。原始沉积量和消解动态结果中，不同试验地点烟叶样品有差距，与施药时作物生长状态和烟草品种有一定关系，湖南的云烟87品种与山东的NC89品种相比，叶面稍皱缩，叶片稍薄，导致湖南烟叶中原始沉积量较山东烟叶的原始沉积量高。温度、湿度和光照强度都与烟叶中农药残留量降解呈正相关，试验时间为6～8月份，湖南点温度较高、相对湿度大，导致湖南烟叶中三唑酮的降解速率高于山东烟叶。

表1 三唑酮在鲜烟叶中残留消解动态试验结果Tab.1 Results of dynamic degradation of triadimefon in fresh tobacco leaves

2.4 不同因子对烤后烟叶中农药残留量的影响

烘烤是烟叶品质固定和彰显烟草特殊香气的过程，烘烤过程中，大量水分散失，烟叶中内含物质在高温高湿条件下充分醇化[13-14]，烟叶中农药残留也在生物酶的作用下有明显降解。经过测定山东、湖南2地试验样品，三唑酮有效用量以150 g/hm2和225 g/hm2剂量在烟草采烤前期施药2次、3次，末次施药后7d、14d、21 d，烤后烟叶中残留量有较大差异，7 d时0.33 mg/kg ～6.44 mg/kg，14 d时残留量0.15 mg/kg ～2.77 mg/kg，21 d 时残留量 0.18 mg/kg ～2.53 mg/kg（表2）。

在施药剂量、次数、采收间隔期等不同因素比较中，采收间隔期和施药剂量两个因子对烟叶中残留量影响都达到了显著水平（表3）。施药次数单因子及其他复合因子对烟叶中残留量影响不显著。在生产中可通过延长从末次施药到采收的间隔期和规范施药剂量两种措施来控制农药残留。

表2 三唑酮、三唑醇在烤后烟叶中最终残留试验结果Tab.2 Results of degradation of triadimefon and metabolite in cured tobacco leaves

表3 不同因子对残留量影响因子统计分析Tab.3 The statistical analysis of in fl uencing factor to pesticide residues

2.5 储存过程对烟叶农药残留量的影响

三唑酮在烟丝中的贮藏结果（表4）表明，三唑酮在烟丝中的残留量随着储藏时间的延长逐渐下降。经过实际测定，高浓度处理原始沉积量为9.68 mg/kg，低浓度处理原始沉积量为1.92 mg/kg，在不同储存时间取样后检测，烟丝中农药残留量有较大差异。三唑酮在烟叶中的残留量与贮藏天数符合负指数型函数的一级动力学特征。烟叶中添加较高浓度（10 mg/kg）三唑酮时，其理论残留半衰期分别为288 d、315 d；烟叶中添加较低浓度（2 mg/kg）三唑酮时理论残留半衰期分别为157 d、198 d。由于在储存环境中，空气湿度较低、烟叶中含水量较小、无光照促进等原因，导致储存期农药残留降解较慢，同时烟叶中三唑酮残留降解率与农药残留原始浓度有一定相关性。

表4 三唑酮在贮藏过程中的消解动态结果Tab.4 Decline dynamics of Triadimefon in storage condition

3 结论

根据农药特点和病害发病特征、发生时期，建议三唑酮防治白粉病，在白粉病发病初期用药，施药2次，每次间隔7d～10d，有效成分用量112.5 g /hm2～150 g /hm2。三唑酮在烟叶中残留限量为5 mg/kg，安全间隔期为14 d。

田间生长过程中，在温度、光照等外部条件影响下，烟叶中含有的多种代谢酶可以明显降解农药残留，但在烟叶储存过程中，储存环境影响了酶的代谢，导致农药残留降解较慢。烟叶中三唑酮残留量与施药剂量和采收间隔期显著相关，在烟叶生产中，通过规范施药剂量和延长采收间隔期的措施可有效降低烟叶中三唑酮农药残留。

针对常规残留实验室常用的气相色谱开发了烟叶中三唑酮及代谢物三唑醇的农药残留检测方法，添加回收率符合农药残留检测的要求，具有良好的重现性和再现性，可以为烟叶中三唑酮及代谢物农药残留检测方法提供技术参考。

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Degradation of triadimefon and its metabolites residues in tobacco leaves

LI Yiqiang1, YANG Liqiang1,2,LIU Wanfeng3, XU Guangjun1, SUN Jianhong2, CAO Shoutao2, GAO Yun2, XU Jinli1, ZHENG Xiao1
1 Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences.Key Laboratory of Tobacco Pest Monitor and Control & Integrated Management, Qingdao 266101, China;2 China Tobacco Shandong Industrial Co., Ltd., Jinan 250100, China;3 China Tobacco Hunan Industrial Co., Ltd., Changsha 471000, China

Degradation of triadimefon and its metabolites triadimenol in tobacco leaves were investigated under GAP conditions.A method for simultaneous determination of triadimefon and its metabolite triadimenol in tobacco was established by method of gas chromatography with electron capture detector (GC-ECD).The limits of quanti fi cation (LOQs) of the proposed method were 0.01and 0.05 mg/kg in fresh tobacco leaves and cured tobacco leaves, respectively.The average recoveries of triadimefon and its metabolite triadimenol in fresh tobacco leaves and cured tobacco leaves were in the range of 79.8%～97.3% with relative standard deviation (RSD) of 1.5%～9.0% when spiked at 0.01～5.0 mg/kg.Results showed that half-life of triadimefon under fi eld and storage conditions were 3.8 ～ 5.6d and 157～ 315d,respectively.The terminal residues of triadimefon in cured tobacco leaves were 0.33 ～ 6.44 mg/kg, 0.15 ～ 2.77 mg/kg and 0.18 ～ 2.53 mg/kg when collected 7, 14, 21 days after last application.It was recommended that the MRL of triadimefon in tobacco leaves was 5 mg/kg with safety interval (PHI) of 14 days.

triadimefon and its metabolite; tobacco; residue; degradation

李义强，杨立强，刘万峰,等.三唑酮及其代谢物在烟叶中的降解规律[J].中国烟草学报，2015,21（5）

国家烟草专卖局项目(TS-06-20110039) ；农业行业财政专项（201203091）

李义强（1976—），博士，研究员，主要从事农药残留与农产品质量安全研究，Tel：0532-88702236，Email: liyiqiang1008@163.com

2014-03-12

:LI Yiqiang, YANG Liqiang, LIU Wanfeng, et al.Degradation of triadimefon and its metabolites residues in tobacco leaves [J].Acta Tabacaria Sinica, 2015, 21(5)