荧光素酶标记人肝癌细胞的动物模型的建立

李海滨孙煦勇秦 科邓添薪赵国志黄程新覃音红杨 柳

（1.中国人民解放军第三〇三医院移植医学研究院，广西移植医学重点实验室，广州军区器官移植中心，广西 南宁 530021；2.广西医科大学第一附属医院，广西 南宁 530021；3.广西医科大学，广西 南宁 530021）

荧光素酶标记人肝癌细胞的动物模型的建立

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（1.中国人民解放军第三〇三医院移植医学研究院，广西移植医学重点实验室，广州军区器官移植中心，广西 南宁 530021；2.广西医科大学第一附属医院，广西 南宁 530021；3.广西医科大学，广西 南宁 530021）

目的：利用荧光素酶基因标记的人肝癌细胞株HEPG2建立裸鼠肝原位移植动物模型。方法：裸鼠肝门静脉接种1×106个细胞使其成瘤，经活体荧光成像观察肿瘤的生长情况。结果：利用荧光索酶基因标记的人肝癌细胞HEPG2，成功建立了原位肝癌裸鼠模型。结论：利用荧光索酶基因标记的人肝癌细胞HEPG2，可建立了原位肝癌裸鼠模型。小动物活体成像可为原位肿瘤模型的建立提供了一种新的可靠的技术，为进一步研究肝癌生长转移机制和药物开发提供了新的有用工具。

荧光素酶；肝癌；动物模型

生物发光成像是目前常用的活体成像技术之一，与其他影像学技术相比，荧光素酶发光的特点是在哺乳动物组织和细胞中的背景非常低小，细胞自身的内源性光较低，穿透力强，具有更高的灵敏度，生物发光技术成像因其操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高，活体可在不同时间点观察，从而减少实验动物数量，目前已广泛应用于生命科学、医学及药物研究等领域[1,2]。本移植中心每年完成 30～50例肝移植患者中多数为肝癌患者，为更好地监测转染了抗癌基因的细胞植入体内的动向及效果，给予患者有效的治疗，本研究利用表达了荧光素酶的肝癌细胞株HEPG2建立了裸鼠肝原位移植动物模型。利用生物发光成像技术对此模型内的肿瘤生长进行非侵入性的连续监测，同时评价生物发光成像在裸鼠肝原位移植模型建立中的作用，为肝癌生长转移机制的研究和药物开发以及细胞治疗提供有效手段。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1试剂与仪器

人肝癌细胞HEPG2由加拿大UBC大学戴龙君教授惠赠，L-谷氨酰胺(GIBICO公司)，双抗(GIBICO公司)，DMEM (GIBICO公司)，胎牛血清（Hyclone公司），荧光素酶底物（Luciferin，Caliper Life Sciences），活体动物荧光成像系统（Lumazone，美国），二氧化碳培养箱（Thermo）。

1.1.2实验动物

BALB/C裸鼠购自广西医科大学实验动物中心（实验动物使用许可证SYXK桂2014-0003），鼠龄6周，体重18～21g，饲养在SPF饲养间。所有实验动物的使用与实验操作程序均经广西医科大学与解放军第三〇三医院实验动物使用管理委员会批准和实验动物福利和伦理委员会的许可。

1.2方法

1.2.1细胞培养

采用DMEM作为基础培养液，配成含10% 胎牛血清、100IU/ml 双抗的培养液，同时设置两孔标记了荧光素酶的细胞与两孔未标记的细胞于96孔板，置于5%CO2、37℃细胞培养箱内培养。

1.2.2裸鼠肝癌原位移植模型的建立和活体荧光观察

收集处于生长对数期的转染细胞，稀释至2×106cells/ml，取250μl细胞悬液进行肝门静脉接种，共接种3只。每隔一周观察一次，连续观察四周，观察前每只裸鼠腹腔注射荧光素底物(1μl/g)，戊巴比妥钠(0．1 ml/g)麻醉后平放于活体荧光影像系统摄像，同时将在96孔板中培养的细胞分别加入荧光素底物后拍照，并用仪器自身所带图像分析软件进行分析。

2 结果

2.1细胞培养

细胞在本实验条件下生长良好，细胞呈梭形或多边形，饱满，贴壁生长（如图1）。

图1　HEPG2细胞

2.2裸鼠肝癌原位移植模型的建立和活体荧光观察

手术注射人肝癌细胞HEPG2后一周，2只小鼠死亡，成活1只。将余下1只小鼠麻醉后平放于活体荧光影像系统摄像，发现裸鼠肝脏出现米粒大小的肿瘤病灶，后面几次略有增大。培养的细胞中加入荧光素底物后拍照可见细胞出现荧光（如图2）。

图2　肝癌原位移植模型与细胞的荧光观察

3 讨论

报告基因(reporter gene)是一组编码易被检测的蛋白质或酶的基因，在调控序列控制下进行表达，其与目的基因融合后的表达产物可用来标定目的基因的表达调控[3-5]。生物发光成像是目前常用的活体成像技术之一，与其他影像学技术相比，荧光素酶发光的特点是在哺乳动物组织和细胞中的背景非常低小，细胞自身的内源性光较低，穿透力强，具有更高的灵敏度，生物发光技术成像因其操作极其简单、所得结果直观、灵敏度高，活体可在不同时间点观察，从而减少实验动物数量，目前已广泛应用于生命科学、医学及药物研究等领域。活体成像技术是目前广泛用于肿瘤转移、基因治疗、干细胞示踪、白血病等相关领域的研究，因此利用Luciferase标记的肿瘤细胞进行小动物活体成像能够更有效地观察肿瘤的发生、发展过程及评价治疗效果[6,7]。

小动物成像技术对能检测的肿瘤动物模型微小病灶的检测灵敏度极高，能够无创、实时、动态的动物活体观察，从而对同一对象进行不同时间点的观察，减少实验动物个体间差异，与传统的方法相比，可大大减少实验动物的用量，同时符合替代、减少、优化的“3R”原则，已成为广泛应用于医学、生物学及药物开发等研究领域[8]。

本实验利用荧光素酶基因标记人肝癌细胞HEPG2，获得稳定表达荧光素酶基因的细胞克隆，经过多次传代表达水平稳定，标记细胞的形态、生长方式、生长速度及致瘤能力等与未转染细胞无明显差异，可以反映HEPG2肿瘤细胞生物学行为的标记细胞。将其经肝门静脉接种裸鼠，用活体荧光成像系统连续观察，发现能够成瘤，并且肿瘤的体积与发光强度有相关性。手术时需注意不要将细胞漏到注射部位外，否则容易对成瘤的成像观察造成影响。动态观察4～6周后，可将成瘤动物安乐死，获取病变组织，按病理程序严格操作留样，相关研究结果将后续报道。

综上所述，利用荧光素酶基因标记的人肝癌细胞HEPG2成功建立了原位肝癌裸鼠模型，小动物活体成像为原位肿瘤模型的建立提供了一种新的可靠的技术，可为进一步研究肝癌生长转移机制和药物开发以及细胞治疗提供有效技术手段。

致谢

本研究得到了加拿大UBC大学的戴龙君教授的大力帮助，并无私赠送了HEP2细胞，在此表示感谢。

[1] 王一帆,夏睿,郭玉林,等.腺病毒介导荧光素酶报告基因感染间充质干细胞的研究[J].中华核医学与分子影像杂志, 2013,33(6):473-477.

[2] 董苑,李彩霞,赵娴,等.荧光素酶基因稳定表达的间充质干细胞系的构建[J].中华显微外科杂志,2014,(6): 569-572.

[3] 薛秀花,黄晨西.荧光素酶基因的研究进展[J].生物学通报,2013,48(9):1-4.

[4] 张禾璇,单可人,官志忠.报告基因研究及其应用进展[J].国际遗传学杂志,2013,36(1):6-12.

[5] Maita H,Tomita K,Ariga H. A split luciferase-based reporter for detection of a cellular macromolecular complex[J].Anal Biochem,2014,(452):1-9.

[6] 张金栋,吕景礼,李晓艳,等.整合荧光素酶的稳定细胞克隆建立裸鼠肺癌静脉移植瘤模型的探索[J].实用医学杂志,2012,28(7):1055-1057.

[7] Lake M C,Aboagye E O.Luciferase fragment complementtation imaging in preclinical cancer studies[J].Oncoscience, 2014, 1(5):310-325.

[8] 李小颖,高凯,董伟,等.荧光素酶标的人肝癌细胞裸鼠异种移植瘤模型的生物发光成像和PET-CT成像比较[J].中国比较医学杂志,2011,(3):10-13.

Establishment of the animal model with human hepatoma cell labelled with luciferase

Objective:To establish hepatic carcinoma mouse model with human HEPG2 cells expressing luciferase. Methods:1×106cells which constitutively expressing lueiferase were inoculated to liver of BALB／c-nu through hepatic portal vein for assessment of tumor growth with the whole-body optical imaging system.Results:Successfully establish hepatic carcinoma mouse model with human HEPG2 cells expressing luciferase.Conclusion:Hepatic carcinoma mouse model with human HEPG2 cells expressing luciferase can be successfully made,which is a new tool to further study the mechanism of metastasis and drug discovery.

Luciferase;hepatoma;animal model

R392.4

A

1008-1151(2015)06-0102-02

2015-05-12

广西自然基金（2013gxnsfaa019253）；广西科学技术开发与研究项目（桂科攻14124003-8）。

李海滨，男，中国人民解放军第三〇三医院移植医学研究院实验师，从事转基因与克隆、分子生物学、移植免疫学研究。

孙煦勇，中国人民解放军第三〇三医院移植医学研究院，广西移植医学重点实验室主任医师，博士，硕士生导师。