超高效液相色谱检测黄樟素方法研究

翟晚枫，李 彭，贺剑锋，高利生

（公安部物证鉴定中心，北京 100038）

·论 著·

超高效液相色谱检测黄樟素方法研究

翟晚枫，李 彭，贺剑锋，高利生

（公安部物证鉴定中心，北京 100038）

本文建立了检测黄樟素的超高效液相色谱定量分析方法。将黄樟素样本以甲醇稀释，1500 r/min振荡10 min或超声3 min，以0.22 μm滤膜过滤后供仪器分析，对流动相梯度程序进行了考察和优化。采用岛津ODS-SP型（250 mm×4.6 mm， 5 µm）色谱柱，以高纯水（A）-乙腈（B）体系作为流动相，梯度程序为60%B（0.01 min）～66.5%B（13 min）～95%B（13.01 min）～95%B（20 min），流速1 mL/min，柱温40℃，进样量5μ L，主定量波长210 nm，辅定量波长235 nm。实验结果表明，随着有机相初始浓度的升高，黄樟素色谱峰的理论塔板数减小、峰高增加、保留时间缩短；随着梯度陡度的增加，黄樟素色谱峰的理论塔板数和峰高均增加、保留时间缩短。经过方法优化，所测黄樟素样品色谱行为良好，在2～200 μg/mL范围内线性良好，外标工作曲线为Y=1833.39X+5675.32，相关系数高于0.9999。以信噪比S/N＞3计算，检测限为0.1 μg/mL。日内精密度≤1.26%，日间精密度≤2.08%。加标回收率在98.21%～102.18%之间，RSD为0.35%～0.96%。在室温放置96 h、-20℃放置15 d以及在室温和-20℃反复冻融3次的条件下均可保持稳定。该方法快速、简便、高效、可靠。

超高效液相色谱；黄樟素；定量分析

黄樟素，又名黄樟油素、萨富罗尔、黄樟脑、黄樟醚、丙烯基二氧甲苯酯，化学名为1-烯丙基-3，4-二氧亚甲基苯，化学式C10H10O2，结构式见图1，相对分子质量162.19，CAS号94-59-7，是无色或淡黄色液体，具有茴香味或樟木味。它是合成苯环上具有亚甲二氧基环的苯丙胺类兴奋剂（如MDMA、MDA）的原料，也可用于香料、添加剂、杀虫剂、防腐剂等化工生产［1］。黄樟素天然存在于黄樟油、大叶樟油等天然芳香油中，可从这些天然芳香油中或黄樟树的根、叶茎中分离或萃取，再经蒸馏精制得到［1，2］。黄樟素可直接用溴化氢进行溴化反应，得到的中间体再进一步用来合成MDMA、MDA。

图 1 黄樟素的化学结构式Fig.1 Chemical structure of safrole

目前，黄樟素分析方法主要有气相色谱法［3，4］、气相色谱-质谱联用法［5，6］和液相色谱法［7］。由于实际办案中遇到的检材多为液态，液相色谱法与气相色谱法相比，在定量时无需萃取步骤，可大幅提高准确度和工作效率，因此更适合作为定量检测的手段。超高效液相色谱法（ultra performance liquid chromatography， UPLC）以高效液相色法（high performance liquid chromatography， HPLC）的理论及原理为基础，通过减小填料颗粒粒径、降低系统体积及应用快速检测手段等方式增加了分析通量、灵敏度及分离度，具有非常广阔的应用前景。本研究以超高效液相色谱为检测手段，探索黄樟素的定量分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪（日本岛津公司Prominenece UFLC，包括LC-20AD XR型泵、SIL-20AC XR型进样器、二极管阵列检测器和紫外检测器、CTO-20AC型柱温箱、数据处理软件LC solution）；十万分之一电子分析天平（瑞典METTLER公司）；涡旋混合器（EYELA型，日本EYELA公司）；超声振荡器（KQ3200型，昆山市超声仪器有限公司）；台式高速冷冻离心机（德国SIGMA公司）；纯水制备系统（Synergy UV型，美国Millipore公司）；移液枪（100～1000 μL，德国Eppendorf公司）；瓶口移液器（标称容量10 mL，德国Brand公司）。

甲醇（前处理使用分析纯、液相色谱流动相使用色谱纯，分别购自国药集团化学试剂有限公司和美国Fluka公司）；乙腈购自美国Fisher Scientific公司；黄樟素标准品购自美国Cerilliant公司；黄樟素样品来源于案件中收缴。

1.2 色谱质谱条件

液相色谱条件：采用岛津ODS-SP型（250 mm×4.6 mm，5 µm）色谱柱；采用梯度洗脱方式，以高纯水（A）-乙腈（B）体系作为流动相，梯度程序为60%B（0.01 min）～66.5%B（13 min）～95%B（13.01 min）～95%B（20 min），流速1 mL/min，柱温40℃；紫外检测器设定210 nm为主定量波长、235 nm为辅定量波长；进样量5μ L。

1.3 样品前处理方法

取适量黄樟素样本，以适量甲醇稀释，1500 r/ min振荡10 min或超声3 min，以0.22μm滤膜过滤后取1.5 mL装瓶供仪器分析。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理

实验中对黄樟素的溶解性进行了考察，结果表明，一方面，黄樟素易溶于甲醇、乙醚、苯、氯仿等有机溶剂，难溶于水和甘油。而另一方面，虽然黄樟素易溶于乙腈，但由于方法最终确定的流动相是高纯水和乙腈，以乙腈稀释时会产生溶剂效应，峰形差。采用甲醇提取时溶解性佳、峰形好，且甲醇的毒性相对较小，故选择甲醇作为提取溶剂。

2.2 检测波长的选择

为实现对不同波长下色谱响应的考察，采用二极管阵列检测器（DAD）对黄樟素标准品进行了分析，获取的保留时间-吸收波长-吸光度三维等高线视图和光谱图见图2、图3。考虑到低检测波长易受到流动相本底干扰，可能对基线、色谱峰形和峰面积造成不利影响，在参考了信噪比数据之后，最终选择210 nm作为主定量波长，235 nm作为辅定量波长。

2.3 色谱条件优化

实验中对黄樟素的液相色谱条件进行了优化。由于黄樟素极性较弱，故选择反相色谱、C18色谱柱，见图4～图7，随有机相初始浓度的升高，黄樟素色谱峰的理论塔板数减小、峰高增加、保留时间缩短；随梯度陡度的增加，黄樟素色谱峰的理论塔板数和峰高均增加、保留时间缩短。综合考虑柱效高、响应强、分析时间短、抗干扰性强等因素，有机相占比应较高，而梯度陡度应较平缓（主要是为确保目标物与杂质的分离度），最终确定的梯度程序为60%（0.01 min）～66.5%（13 min）～95%（13.01 min）～95%（20 min），流速1 mL/min，柱温40℃，进样量5μ L。优化条件下的黄樟素标准品（20μ g/mL）的色谱图见图8。

图 2 黄樟素保留时间-吸收波长-吸光度三维等高线视图Fig.2 3D contour view of safrole's wavelength-absorbance retention time-absorption

图 3 黄樟素的光谱图Fig.3 Spectrum of safrole

图 4 有机相初始浓度对理论塔板数的影响Fig.4 Effect of organic phase's initial content on theoretical plate number

图 5 有机相初始浓度陡度对峰高的影响Fig.5 Effect of organic phase's initial content on peak height

图 6 梯度陡度对理论塔板数的影响Fig.6 Effect of gradient steepness on theoretical plate number

图 7 梯度陡度对峰高的影响Fig.7 Effect of gradient steepness on peak height

2.4 方法验证

2.4.1 线性范围和工作曲线结合办案实际需要，实验考察了黄樟素在2～200 μ g/mL浓度范围内的线性情况，并建立了外标工作曲线。实验结果表明，目标物在2～200 μg/mL范围内线性良好，工作曲线为Y=1833.39X+5675.32，线性相关系数高于0.9999。以信噪比S/N＞3计算，检测限为0.1 μg/mL。

2.4.2 精密度测定制备浓度为200.0、20.0 μg/mL、2.0 μg/mL的混标溶液，每日进样6次，以外标工作曲线计算含量，得到日内精密度（相对标准偏差，RSD）；连续测量6 d，以外标工作曲线计算含量，得到日间精密度（相对标准偏差，RSD）。结果表明，黄樟素日内精密度均小于1.26%，日间精密度均小于2.08%。

2.4.3 加标回收率测定为验证所建立的方法是否存在系统性偏差，实验中对加标回收率进行了考察。分别选择3.2%、15.3%两种含量的样品，各精密称取3份，分别加入约为已知含量的50%、100%的标准品，以甲醇稀释，振荡混匀后经液相色谱分析，每个浓度重复测定3次，计算加标回收率。结果表明，加标回收率98.21%～102.18%，RSD 0.35%～0.96%，方法不存在系统性偏差。

图 8 黄樟素标准品的UPLC色谱图Fig.8 UPLC chromatogram of safrole standard

2.4.4 稳定性实验取等量的20.0 μg/mL的混合标准溶液18份，其中6份于室温下分别放置3、6、12、24、48、96 h，分别进样，黄樟素色谱峰面积RSD 0.35%～1.02%；3份于- 20℃冰箱中分别放置5、10、15 d，峰面积RSD 0.58%～1.67%；另外3份于- 20℃冰冻和恢复至室温条件下反复3次，峰面积RSD 0.26%～0.93%。结果表明，黄樟素在上述条件下均可保持稳定。

2.5 案例应用

某案件中缴获1桶未知成分浅黄色液体。振荡混匀后平行取两个各50μL的样品，分别以20 mL甲醇稀释，采用前文确定的样品处理方法和优化的色谱条件对其进行分析，所得液相色谱图见图9。样品保留时间为10.95 min，与黄樟素标准品色谱峰保留时间相差不超过1%。经计算，黄樟素含量平均值为7.08%。同时，经GC-MS分析，确证该目标物为黄樟素。

结果表明，使用本文建立的方法，黄樟素色谱行为良好，方法快速、简便、高效、可靠，适于推广应用于公安办案中黄樟素样品的定量分析。

图 9 某黄樟素液体样本的超高效液相色谱图Fig.9 UPLC chromatogram of safrole liquid sample

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Determination of Safrole by Ultra Performance Liquid Chromatography

ZHAI Wanfeng， LI Peng， HE Jianfeng， GAO Lisheng
（Institute of Forensic Science， Ministry of Public Security， Beijing 100038， China）

To establish a quantitative method for determination of safrole by ultra performance liquid chromatography（UPLC）， safrole samples were diluted by methanol， oscillated with the speed of 1500r/min for 10 minutes or ultrasoundassisted oscillated for 3 minutes， then fi ltered the solution with 0.22 μm membrane and drew 1.5 mL for automatic injection. The separation was optimized and performed on a Shimadzu ODS-SP column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）. The mobile phase was pure water （A）-acetonitrile （B） and the mode of elution was gradient. The initial condition was 60%B， and the gradient steepness of organic phase was 0.5%/min between 0～13 min， then the organic phase's content was raised to 95% immediately and held on for 7 minutes. The complete gradient elution procedure was 60%B （0.01 min）～66.5% B （13 min）～95%B （13.01 min）～95% B （20 min）. Flow rate was set as 1 mL/min， column temperature was set as 40℃ and injection volume was set as 5 μL. The primary quantitative wavelength of UV detector was set as 210 nm and the auxiliary one was set as 235 nm. When the organic phase's initial content increased， theoretical plate number and retention time decreased， but peak height increased. When the gradient steepness increased， theoretical plate number and peak height increased， but retention time decreased. Using the optimized method， good linearity was achieved over the range of 2～200 μg/mL. External standard working curve Y=1833.39X+5675.32， r2＞0.9999. Limit of detection was 0.1 μg/mL under the condition of S/N＞3. The precision was good with the intra-day RSDs less than 1.26% and inter-day RSDs less than 2.08%. The accuracy was also satisfi ed. The recovery rates were in the range of 98.21% to 102.18%， with RSDs between 0.35% and 0.96%. The test samples showed good stability under room temperature， freeze condition and three cycles of freeze-thaw condition. The RSDs of peak area of 6 samples placed at room temperature for 3， 6， 12， 24， 48， 96 hours were between 0.35% and 1.02%. The RSDs of 3 samples placed in refrigerator at -20℃ for 5， 10， 15 days were between 0.58% and 1.67%. The RSDs of 3 samples which were frozen and thawed three times were between 0.26% and 0.93%. The method was proved to be good when applied to case samples. For example， once we received an unknown sample seized by police， and then used the extraction and chromatography methods to analyze the sample， the major analyte's retention time was consistent with safrole standard and the quantitative result was 7.08%. This method was rapid， simple， effective and suited for quantitative determination of safrole.

ultra performance liquid chromatography ； safrole； quantitative analysis

DF795.1

A

1008-3650（2015）03-0204-04

2014-12-15

格式： 翟晚枫， 李彭， 贺剑锋， 等. 超高效液相色谱检测黄樟素方法研究 ［J］. 刑事技术， 2015，40（3）：204-207.

中央级公益性科研院所基本科研业务费项目（No. 2013JBYY002）

翟晚枫（1987—），女，山东曲阜人，硕士，研究实习员，研究方向为毒品检验。 E-mail： 1004503680@qq.com

10.16467/j.1008-3650.2015.03.008