五味子甲素对粪肠球菌毒力因子作用的初步研究

崔 红, 许 颖, 吴 清

(佳木斯大学附属第二医院, 黑龙江 佳木斯 154007)

五味子甲素对粪肠球菌毒力因子作用的初步研究

崔 红, 许 颖, 吴 清

(佳木斯大学附属第二医院, 黑龙江 佳木斯 154007)

目的: 研究五味子甲素对粪肠球菌生物膜的抑菌效果及其对某些毒力因子表达的影响。方法： 体外建立粪肠球菌生物膜模型，分别与31.25、62.5、125、250、500 μg/mL五味子甲素、仅含菌液不含药物的BHI培养基(阴性对照)、仅含BHI液体培养基的空白对照组共同培养12 h后，MTT法检测各组抑菌效果；根据抑菌效果选取适宜药物浓度(125、250、500 μg/mL)与粪肠球菌共同培养24 h后，RT- PCR法检测各组粪肠球菌毒力因子srtC、esp、ebpR mRNA的表达水平。结果：五味子甲素对粪肠球菌生物膜的抑菌作用随药物浓度的增加而升高(P<0.05)，其中以500 μg/mL组的抑菌效果最好； 125、250、500 μg/mL的五味子甲素均能明显抑制srtC、esp、ebpR各毒力因子mRNA的表达，且其抑制程度均随着药物浓度的增加而增加(P<0.05)，当药物浓度为500 μg/mL时，可完全抑制srtC、ebpR mRNA的表达。结论：一定浓度的五味子甲素不仅能抑制生物膜状态的粪肠球菌，同时还能抑制其毒力因子srtC、esp、ebpR的表达。

五味子甲素; 粪肠球菌; 生物膜; 毒力因子; RT- PCR

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.01.005

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(1): 24]

牙髓病和根尖周病是口腔常见的细菌感染性性疾病，其治疗方法主要为根管治疗术。近年来，随着治疗手法和仪器的不断改进，其成功率虽有显著提高，但仍存在一定的失败率。研究表明，粪肠球菌是导致根管治疗失败的最常见的细菌之一[1-2]，该菌对生存环境的要求较低，能在缺氧、饥饿等恶劣环境下长期存活并形成生物膜；形成生物膜后其耐药性和治疗难度均远远高于游离菌,很难用传统的治疗方法将其清除。因此，关于粪肠球菌导致根管治疗失败所起的作用受到越来越多的关注。加之目前临床上常用的根管消毒药物对根管内粪肠球菌的清除效果不佳；甚至有些药物还存在一定的毒副作用，或使粪肠球菌产生耐药性，故多数学者将目光转向毒副作用相对较小且不易产生耐药性的中药。本实验旨在观察五味子甲素对粪肠球菌生物膜的抑菌效果并探讨其对粪肠球菌毒力因子srtC、esp、ebpR转录表达水平的影响。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

粪肠球菌标准株ATCC(南京便诊生物科技有限公司)；五味子甲素标准品(上海金穗生物科技有限公司，产品批号20140109，HPLC≥98%)；脑心浸液肉汤(BHI)、琼脂培养基( 青岛海博生物科技有限公司)；噻唑蓝MTT、二甲基亚砜DMSO(广州宝态克生物科技有限公司)；RNA 提取试剂、PCR反应试剂和DNA Marker( 大连宝生物工程有限公司)；引物( 上海生工生物工程有限公司)；电子分析天平( 赛多利斯科学仪器北京有限公司)；激光共聚焦显微镜(Olympus,日本)；Biometra PCR仪(BIOME-TRA，德国)；TGL- 20M高速台式冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；SMART SPECTMPLUS 超微量分光光度计(美国)；Tanon2500R数码凝胶图像处理系统(海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备

将冻存的粪肠球菌标准株接种于BHI液体培养基，置于摇床上37 ℃厌氧条件下复苏培养24 h。取复苏后的粪肠球菌接种于BHI固体培养基并置于37 ℃恒温培养箱中厌氧条件下培养24 h后，再将培养物转种于BHI液体培养基中继续培养24 h；然后用麦氏比浊法配制菌悬液，并调整细菌浓度为0.5 McFarland( 1×108/mL)备用。

1.2.2 含药培养基的制备

取五味子甲素标准品用甲醛溶液配制成1 mg/mL 的母液，过滤后再用BHI肉汤培养基依据二倍稀释法将母液稀释成浓度依次为：500、250、125、62.5、31.25 μg/mL的含药培养基备用。

1.2.3 不同浓度五味子甲素对粪肠球菌的抗菌作用观察

取灭菌后的96孔板，分别在每孔中各加入50 μL 粪肠球菌菌悬液和150 μL BHI培养基，封口膜封口后置于37 ℃培养箱中厌氧培养24 h。抽样检测(激光共聚焦显微镜观察)确定生物膜模型建立成功后，弃原培养液，并将其随机分为7组(5个实验组、1个阴性对照组和1个空白对照组)；5个实验组分别加入含五味子甲素浓度为500、250、125、61.25、31.25 μg/mL的 BHI培养基各100 μL，阴性对照组加入仅含菌液不含药物的BHI培养基100 μL，空白对照组加入不含菌液和药物的BHI培养基100 μL，一并置37 ℃厌氧条件下继续培养12 h。培养结束后分别取各组标本，用PBS溶液冲洗2～3次后，每孔加入5 mg/mL 的MTT各 20 μL，37 ℃避光孵育4 h;PBS 冲洗2～3次后再于每孔中各加入150 μL DMSO溶液，并置于摇床上震荡15 min；待结晶充分溶解后,用全自动酶标仪分别检测各孔490 nm波长处的吸光值(A490)，并按以下公式计算各组的抑菌率(%)。

1.2.4 不同浓度五味子甲素对粪肠球菌毒力因子表达影响的观察

1.2.4.1 分组处理和PCR扩增

取粪肠球菌菌液分别接种于含五味子甲素浓度为500、250 、125 μg/mL和0 μg/mL(阴性对照组)的BHI培养基，置于37 ℃ 厌氧条件下培养 24 h后，分别从每组中各取1 mL培养液按 RNAiso TM Plus(Total RNA 提取试剂)说明提取其总RNA；并用RNA PCRkit(AMV)Ver 3.0试剂盒反转录合成 cDNA。然后用3对相应引物(上海生工设计合成,具体序列见表1)用Biometra PCR仪并按PCR反应试剂盒说明对粪肠球菌毒力因子srtC、esp、ebpR 基因进行扩增。PCR扩增产物置-20 ℃ 冰箱保存备用。

表1 PCR 引物序列

1.2.4.2 琼脂糖凝胶电泳及分析

取0.3 g琼脂糖与25 mL 1×TBE电泳缓冲液混合，加热制成凝胶后，再加入0.2 μL EB混匀并将其倒入凝胶板中凝固15 min备用。取10 μL PCR 反应产物与2 μL 6×Loading buffer混匀后，置于琼脂糖凝胶小孔中，于110 v、25 min条件下跑电泳。电泳结束后将凝胶板置于凝胶成像仪UVI下进行观察；采用Taona 2500 R凝胶图像处理软件测量各电泳条带的吸光度值，并分析各目的基因的相对表达值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度五味子甲素对粪肠球菌的抑制率

不同浓度五味子甲素作用粪肠球菌12 h后，MTT法检测各组的吸光值并计算其抑菌率，结果显示：31.25～500 μg/mL五味子甲素对粪肠球菌均有一定的抑制作用，各浓度组的抑菌率分别与阴性对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中以31.25 μg/mL组的抑菌率最低，但随着药物浓度的增加，其抑菌率逐渐增高，各药物浓度组间两两相比差异均有统计学意义(P<0.05)；而阴性对照组与空白对照组相比无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表2 各组A值及抑菌率比较

不同字母组间P<0.05

2.2 五味子甲素对 srtC、esp、ebpR表达水平的影响

粪肠球菌菌悬液分别与 500、250、125、0 μg/mL(阴性对照组) 五味子甲素共同培养24 h后，PCR扩增产物电泳结果显示：①阴性对照组和药物浓度为 125 μg/mL时，3种毒力因子的条带均比较清晰；②随着药物浓度的增加，各毒力因子的条带亮度均逐渐变淡，当药物浓度为500 μg/mL时， srtC 和 ebpR 条带消失，而esp条带只是变淡并没有消失(图1)。利用凝胶图像系统处理软件对各电泳条带进行定量分析显示：各浓度药物组的srtC、esp、ebpR mRNA表达水平均明显低于阴性对照组(P<0.05)，其降低程度均随着药物浓度的增加而增加，各浓度组间两两相比均P<0.05(表3)。以上结果说明，125～500 μg/mL不同浓度五味甲素对粪肠球菌的3种毒力因子srtC、esp、ebpR 的表达均有不同程度的干扰或抑制作用，当其浓度达到500 μg/mL时，可完全抑制srtC和ebpR mRNA的表达，但不能完全抑制esp mRNA的表达。

1～4为srtC；5～8为esp；9～12 ebpR；各基因的序号分别代表不同药物浓度，从小到大依次为0、125、250、500 μg/mL

图1 各组srtC、esp、ebpR的PCR产物凝胶电泳结果

同一种基因不同药物浓度组间两两相比，不同字母组间P<0.05

3 讨论

五味子甲素是木兰科(Magnoliaceae)植物五味子的干燥成熟果实的主要有效成分之一，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心等作用[3]。研究表明五味子对粪肠球菌有一定的抑制作用[4]，故本实验以五味子的有效成分五味子甲素为对象，观察其是否也具有抑制粪肠球菌的作用。结果显示，31.25～500 μg/mL不同浓度五味子甲素作用于粪肠球菌生物膜后，其抑菌率随着药物浓度的增加而增高，当药物浓度为500 μg/mL时，抑菌效果最明显。

粪肠球菌是继发性根管内感染的主要致病菌，与初次感染的根管相比，其数量增多，且大部分细菌已形成生物膜，从而导致其具有极强耐药性，使治疗变得非常困难。有研究认为，粪肠球菌在根管内形成生物膜与其以下3种毒力因子有关：①分选酶sortase，该酶是一组介导细菌表面蛋白与G+细菌细胞壁共价结合的蛋白酶，是细菌粘附并发挥毒力作用的关键因子，根据其识别表面蛋白序列的不同，可分为 A、B、C、D等多种[5]，其中srtA 在细菌锚定到菌细胞表面的过程中发挥重要作用；srtC是粪肠球菌生成菌毛、形成生物膜和诱导心内膜炎发生的重要因子，当srtA 基因缺失时，srtC和(或)其锚定的蛋白可以补偿srtA 的部分功能[6]；②esp编码的肠球菌表面蛋白，该蛋白是类肠球菌细胞壁上相对分子量较大的一种表面蛋白(1 873个氨基酸)[7],由其具有介导细菌粘附的作用,在粪肠球菌生物膜的研究中逐渐受到重视[7-8]； ③ebp，ebp基因座可影响菌毛形成[9]，其中ebpR是ebpABC的转录调节子，ebpABC作为粪肠球菌菌毛相关操纵子，普遍存在于粪肠球菌分离株中，与其菌毛的生成和生物膜形成有关[8]。

为进一步探讨五味子甲素对粪肠球菌的抑制作用是否通过影响其相关毒力因子的表达而实现的，本实验选取与粪肠球菌形成生物膜有一定关系的3种毒力因子(srtC、esp、ebpR)为对象，观察其在不同浓度五味子甲素作用下的表达变化。结果显示，125～500 μg/mL不同浓度五味子甲素对粪肠球菌的3种毒力因子srtC、esp、ebpR mRNA的表达均有不同程度的干扰或抑制作用，当药物浓度达到500 μg/mL时，可完全抑制srtC和ebpR mRNA的表达，但不能完全抑制esp mRNA的表达。提示，五味子甲素对粪肠球菌生物膜及其生物膜形成相关毒力因子均有明显的抑制作用。

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The effects of Schisandrin A on the virulence factors ofenterococcusfaecalis

CUI Hong, XU Ying, WU Qing

(SchoolofStomatology,JiamusiUniversity,Jiamusi154007,China)

AIM: To investigate the antibacterial effect of schisandrin A onEnterococcusfaecalisbiofilm and on the expression of the virulence factors. METHODS:Enterococcusfaecalisbiofilm was cultured in vitro. TheEnterococcusfaecalisbiofilm was co- cultured with schisandrin A at 31.25,62.5,125,250 and 500 μg/mL respectively for 12 h, MTT assay was conducted to determine the viable ofEnterococcusfaecalisin the biofilm.Enterococcusfaecalisbiofilm was co- cultured with schisandrin A at 125,250, and 500 μg/mL for 24 h, then srtC, esp and ebpR mRNA was examined by RT- PCR. RESUITS: Schisandrin A showed a dose- dependent inhibitory effect onEnterococcusfaecaliswiability(P<0.05). The highest inhibition was achieved at 500 μg/mL of schisandrin A. Moreover, schisandrin A decreased srtC,esp and ebpR mRNA in a concentration dependent manner(P<0.05). Schisandrin A at 500 μg/mL completely inhibited the mRNA Expression of srtC,esp,and ebpR. CONCLUSION: Schisandrin A can inhibit the proliferation ofEnterococcusfaecalisand the expression of virulence factors srtC,esp, and ebpR mRNA ofEnterococcusfaecalis.

schisandrin a;Enterococcusfaecalis; biofilm; virulence factor; RT- PCR

2014-07-15;

2014-12-01

佳木斯大学研究生科技创新项目(LM2014_045)

崔红(1989- )，女，汉族，黑龙江人，硕士生(导师：许颖)

许颖, E-mail: xuyingjiayi@126.com

R780.2

A

1005-2593(2015)01-0024-04