机械预备与半导体激光对粪肠球菌杀菌作用的体外研究

李亚男, 车晓倩, 王宏伟, 李 茹, 孙慧斌

(山东 青岛 266100: 1.青岛大学附属医院东区口腔科; 2.青岛大学附属医院东区检验科;3.中国科学院青岛生物能源与过程研究所公共实验室)

机械预备与半导体激光对粪肠球菌杀菌作用的体外研究

李亚男1, 车晓倩1, 王宏伟2, 李 茹3, 孙慧斌1

(山东 青岛 266100: 1.青岛大学附属医院东区口腔科; 2.青岛大学附属医院东区检验科;3.中国科学院青岛生物能源与过程研究所公共实验室)

目的: 评价半导体激光对感染根管内粪肠球菌的杀菌效果。方法：成功建立粪肠球菌感染人单根管恒牙模型50个， 用ProTaper F3锉预备根管后随机分为5组(n=10)，A组: 空白对照，不照射激光；另4组分别用不同功率、时间半导体激光照射根管内壁, B组：1.0 W，10 s；C组：1.0 W，20 s；D组：2.0 W，10 s；E组：2.0 W，20 s。各组标本均于处理前、后在根管内壁表面取样并进行细菌培养计数；然后再分别用F4、F5锉依次预备并收集两种深度的牙本质碎屑，经厌氧培养后采用麦氏比浊法进行菌落计数。结果：①各组处理后的根管内壁细菌量均较处理前下降(P<0.05)，各激光组细菌清除率均高于对照组(P<0.05)，而各激光组之间两两相比差异无统计学意义(P>0.05); ②各激光组均能使两种深度牙本质中的细菌量明显减少(P<0.05)；其中照射10 s 时, 2.0 W比1.0 W的杀菌效果好(P<0.05)，而照射20 s时, 不同功率的杀菌效果无显著差异(P>0.05)；用1.0 W时，照射20 s比10 s的杀菌效果好(P<0.05)，而用2.0 W时，照射10、20 s的杀菌效果无差异(P>0.05)。结论：半导体激光对根管内壁及深层牙本质的粪肠球菌均有杀菌作用，其对牙本质深层的杀菌效果随着照射时间延长、功率增大而增强。

粪肠球菌; 半导体激光; 根管治疗; 杀菌率

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.08.006

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(8):483]

根管治疗术是治疗牙髓病和根尖周病的有效方法，但即使经过完善的根管治疗，患牙仍存在4%～15%的失败率[1]，特别是行根管再治疗的患牙，其失败率更高[2]。有研究发现，在难治性和继发性感染的根管中，粪肠球菌是最常分离到的细菌种类，其检出率可达77%[3]，是目前评价各种感染清除措施时最常用的目标菌种。

另有研究表明，粪肠球菌主要以生物膜的形式稳定存在于患牙的根管中[4-5]，并能进入牙本质小管不断释放致病因子，是根管治疗失败的主要原因。由于根管系统的复杂性，传统的机械预备及化学消毒均无法彻底清除根管内的粪肠球菌。因此，寻找一种即安全，又能有效杀灭根管内细菌(特别是粪肠球菌)的灭菌方法，对提高根管治疗术的效果尤为重要。

近年来，关于激光对粪肠球菌的杀菌作用已成为研究热点，激光产生的瞬时高温足以杀灭根管内的细菌，并能清除细菌内毒素等代谢产物，尤其对侧支根管和弯曲根管也有灭菌作用。鉴于半导体二极管激光970 μm的波长所产生的能量能充分被软组织内的水、血红蛋白及黑色素所吸收，适合应用于口腔治疗。本实验通过建立稳定的粪肠球菌感染根管模型，评价半导体二极管激光处理对根管内粪肠球菌的杀菌效果，以期为临床推广应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

粪肠球菌标准菌株冻干粉(ATCC29212，美国)；机用ProTaper镍钛锉(登士柏，美国)；激光治疗仪(西诺德，德国) ；扫描电镜(S- 4800，Hitachi，日本)； CO2培养箱(DY- 2，浙江义乌冷冻机总厂)；CrystalspecTM比浊仪(Becton Dickinson, 美国)。

1.2 标本制备

1.2.1离体牙的选择和预处理

临床收集新鲜拔除的人单根管恒牙54个(均根尖孔发育完全、未行根管治疗、 无根裂等)，置于52.5 g/L NaClO中浸泡消毒24 h后，用慢速切锯截去牙冠，并分别截取其10 mm长的牙根。用ProTaper镍钛锉将各牙根的根管逐步扩大到F3(ISO标准)后，170 g/L EDTA 和10 g/L NaCIO交替超声震荡清洗根管，以去除玷污层。预备完成的所有样本经高温高压灭菌后，随机抽取2个样本，用1 mL无菌PBS溶液冲洗根管，并收集冲洗液进行接种培养；确定无细菌生长后用于感染根管模型的建立。

1.2.2 感染根管模型的建立

本实验感染根管模型建立参照郭惠杰等[6]报道的方法：将粪肠球菌标准株冻干粉常规复苏后划线接种于脑-心浸液(BHI)琼脂培养皿，置于37 ℃、 50 mL/L CO2培养箱中厌氧培养24 h后，挑取数个单菌落转至1 mL BHI液体培养基中，增菌培养48 h。然后取20 μL菌悬液分别注入上述各根管后，将牙根放入含1 mL BHI液体培养基的无菌EP管中(每管1个)，并置于37 ℃厌氧条件下培养；每3 d更换1次菌悬液，连续培养4周。培养结束后随机抽取2个样本，分别沿颊舌向劈开并放入25 mL/L戊二醛中固定48 h后，依次放入300、500、700、800、900、1 000 mL/L乙醇中各15 min 进行逐级脱水；然后常规干燥、喷金，用扫描电镜(×5 000～10 000)对各样本的根管内壁进行观察。确认根管内壁及牙本质小管中粪肠球菌生长(模型建立成功)后用于以下实验。

1.3 实验分组和处理

将上述50个成功建立感染根管模型的样本随机分为A、B、C、D、E 5组(n=10)，其中A组用ProTaper F3锉再次预备，作为空白对照组；其余4组按以下方法进行激光处理，B组: 1.0 W激光照射2次; C组: 1.0 W激光照射4次; D组: 2.0 W激光照射2次; E组: 2.0 W激光照射4次；每次照射5 s，间隔5 s。各激光照射组在每次照射时先将光纤置于根尖孔上方0.5～1 mm处，然后以S形的走向从下往上提拉并逐步退出，不要长时间指向某一点。

1.4 杀菌效果的观察

1.4.1 感染根管内壁细菌量的评估

分别于单纯机械预备(对照组)和激光处理(实验组)前、后取各组感染根管样本，用#30无菌纸尖干燥根管，分别在各根管内注入PBS缓冲液，并将#30无菌纸尖插入根管至根尖孔处(保持纸尖与根管壁相接触)；停留1 min后取出纸尖并立即放入装有PBS溶液的EP管中，用小型振荡器振荡1 min；然后从每个EP管中各吸取5 μL液体，10倍系列稀释后接种培养48 h，分别计算各组的菌落数和细菌清除率。

1.4.2 牙本质小管内杀菌效果的评估

取上述处理取样后的根管标本，分别用ProTaper F4、F5锉收集2个不同深度的牙本质碎屑(牙本质壁下100、200 μm)；然后将碎屑转至装有BHI液体培养基的EP管中进行厌氧培养，并于培养24 h后采用麦氏比浊法进行菌落计数。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 粪肠球菌感染根管模型的建立

根管样本经灭菌后抽样检查发现，培养皿上均未见细菌生长。根管内注入粪肠球菌菌悬液培养4周后，随机抽取2个样本用扫描电镜观察发现，根管内壁有粪肠球菌生物膜形成(图1)，并可见粪肠球菌侵入牙本质小管内定植生长(图2)；提示粪肠球菌感染根管模型建立成功。

图2 粪肠球菌定植于牙本质小管(SEM, ×10 000)

2.2 机械预备和激光对感染根管内壁细菌的清除作用

处理前各组感染根管内壁的原始细菌量相比，差异均无统计学意义(P>0.05)；经机械处理(对照组)和激光处理后(实验组)，各组的细菌量均较其处理前显著下降(P<0.05)，其中A组的细菌清除率为39.45%， B、C、D、E组的细菌清除率分别为92.01%、93.18%、92.64%、92.94%；各激光组分别与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)，而各激光组之间两两相比，差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。提示机械预备和激光处理对根管内壁的粪肠球菌均有清除作用，且激光的除菌效果更好，但不同能量不同时间激光照射对根管内壁表面的杀菌效果无差异。

表1 各组根管内壁粪肠球菌菌落数的比较

*与同组内处理前相比P<0.05；不同字母组间两两相比P<0.05

2.3 机械预备和激光对牙本质小管内细菌的清除作用

各组两种深度部位的牙本质碎屑经厌氧培养后，麦氏比浊法进行菌落计数显示：与对照组相比，不同功率的激光照射不同时间后，均能使两种深度牙本质中的粪肠球菌量明显减少(P<0.05)；其中照射10 s时, 2.0 W比1.0 W的杀菌效果好(P<0.05)，而照射20 s时, 不同功率的杀菌效果无差异(P>0.05)；用1.0 W时，照射20 s比10 s的杀菌效果好(P<0.05)，而用2.0 W时，照射10、20 s的杀菌效果无差异(P>0.05)(表2)。以上结果提示，半导体激光有一定的穿透能力，能杀灭侵入牙本质小管内的细菌，其杀菌效果在一定范围内随着时间延长、功率增大而增强。

表2 各组感染牙本质小管内粪 肠球菌菌落数比较

组间相比不同字母P<0.05; MCF为比浊麦氏浓度单位

3 讨论

根管系统的复杂性决定了根管消毒的重要性，细菌感染是造成根管治疗失败的主要原因。粪肠球菌作为根管治疗后可能分离到的最多的细菌[7-8]，其存在与再治疗根管的临床症状或体征密切相关[9]。粪肠球菌是G+兼性厌氧菌，可侵入到牙本质小管深层，同时还能在根尖部通过形成生物膜[10]而抵制抗菌剂的作用、增强细菌的致病能力及耐药性[11],并使其在寡能量、低体积分数的次氯酸钠及弱碱性环境下均能生长[12]。因此，粪肠球菌可以在常规冲洗剂及诊间氢氧化钙封药中存活下来，从而造成顽固性或继发性根管内感染。

常规机械根管预备完成后，根管内的坏死牙髓组织和根管内壁附着的感染物已被大部分去除，但牙本质小管深层和根管侧支等器械和冲洗液达不到的部位仍有残余的细菌、毒素存在。有研究发现，通过机械的方法预备后虽可使根管内的粪肠球菌总量减少，但不能完全去除，而且不同的预备技术和不同器械清除细菌的能力无显著性差异[13]。所有器械均不能完全去除根管内碎屑和玷污层，尤其是根尖1/3[14]。因此，近年来我们将激光照射引入根管消毒中，以期减少粪肠球菌的数量，提高根管治疗的成功率。

目前，激光已广泛应用于口腔软组织外科手术、黏膜病及牙周抗炎治疗、牙体牙髓治疗等各个领域。激光辅助牙体牙髓治疗主要包括龋病的预防、诊断，去龋备洞，根管治疗，牙漂白及牙本质过敏等。激光照射产生的瞬时高温能气化根管壁残存的碎屑和玷污层，并可通过熔融和封闭牙本质小管而降低牙本质通透性；从而有利于根充材料更紧密接触根管壁，使根管充填更完善、降低根尖渗漏的发生率，防止炎症复发。另外，激光还能改善尖周组织的血液循环，减轻炎症的渗出速度及程度，并使局部组织中的5-羟色胺含量减少，有明显的消炎止痛作用。

本实验在建立粪肠球菌感染根管模型的基础上，观察不同功率的半导体激光照射不同时间后，对根管内粪肠球菌的清除效果，并与单纯机械预备的根管作对比。结果显示，机械预备和激光处理均可使根管内壁的粪肠球菌量明显下降，各激光照射组与单纯机械预备相比杀菌效果更为显著; 进一步证实了单纯机械预备不能完全清除根管内感染，和其他学者的研究结果一致[15-17]。但各激光组之间相比，无论是增大激光功率，还是延长激光照射时间，均不能显著提高其对根管内壁表面粪肠球菌的杀菌率。

本实验发现，粪肠球菌可侵入牙本质小管深层定植生长，故采用F4、F5镍钛锉收集不同深度的牙本质碎屑，以观察各组对不同深度牙本质小管中粪肠球的清除效果。考虑镍钛锉锥度的可变性，认为收集的碎屑大致来自根管壁牙本质100、200 μm的深度。两种深度牙本质碎屑内的粪肠球菌量均较对照组明显减少，说明激光能穿透牙本质而起杀菌作用，并且与时间、功率呈正相关；但当时间或功率超过一定程度后，其中一种因素的变化将不能显著提高杀菌效果。本实验中时间和功率最大值组(20 s，2.0 W)也不能完全杀灭牙本质小管深层的细菌，且杀菌效果不如根管内壁理想，这可能与激光产生的瞬时高热使牙本质熔融后封闭了牙本质小管，从而导致牙本质通透性降低有关。

综上所述，半导体激光能够有效杀灭感染根管内壁、牙本质小管内的粪肠球菌，且操作简便、高效。虽然随着激光功率的增大、照射时间的延长对牙本质深层的杀菌效果更好，但其瞬时产生的能量也越大，有可能对根尖周组织产生热损伤；故建议临床上应在达到杀菌效果的基础上选取较小功率的激光进行多次照射。

[1]Smith CS，Setchell DJ，Harty FJ．Factors influencing the success of conventional root canal therapy- a five- year retrospective study [J].IntEndodJ，1993，26 (6)：321-333.

[2]Sundqvist G，Figdor D，Persson S，etal．Microbiologic analysis of teeth with failed endodontic treatment and the outcome of conservative retreatment [J].OralSurgOralMedOralPatholOralRadiolEndod，1998，85(1)：86-93.

[3]Siqueira IF Jr，Rças IN. Polymerase chain reaction- based analysis of microorganisms associated with failed endodontic treatment [J]．OralSurgOralMedOralPatholOralRadiolEndod, 2004,97(1):85-94.

[4]Distel JW, Hatton JF, Gillespie MJ. Biofilm formation in medicated root canals [J].JEndod, 2002,28(10):689-693.

[5]Nair PN，Henry S，Cano V，etal．Microbial status of apical root canal system of human mandibular first molars with primary apical periodontitis after“one- visit”endodontic treatment [J]．OralSurgOralMedOralPatholOralRadiolEndod, 2005,99(2):23l-252.

[6]郭惠杰，岳林. 粪肠球菌在根管内定植模式的体外研究 [J]. 北京大学学报，2009，41(6)：699-701.

[7]Nair PN．On the causes of persistent apical periodontitis：a review [J]．IntEndodJ，2006，39(4)：249-281.

[8]Stuart CH，Schwartz SA，Beeson TJ，etal. Enterococcus faecalis:its role in root canal treatment failure and current concepts in retreatment [J]．JEndod，2006，32(2)：93-98.[9]牛卫东, 宋其义, 王丽娜, 等. 再治疗根管内粪肠球菌检出及其与临床表征关系的分析研究 [J]. 华西口腔医学杂志，2010，29(5)：535-538.

[10]Peters LB，Wesselink PR，Buijs JF，etal．Viable bacteria in root dentinal tubules of teeth with apical periodontitis [J].JEndod，2001，27( 2)：76-81.

[11]Guerreiro- Tanomaru JM，de Faria- Junior MB，Duarte MA，etal. Comparative analysis of Enterococcus faecalis biofilm formation on different substrates [J].JEndod，2013，39(3)：346-350.

[12]冉淑君，鄂佳，朱彩莲，等. 不同理化条件对粪肠球菌生长周期及生物膜形成能力的影响 [J]. 中华口腔医学杂志社，2013，48(9)：529-534.

[13]Matos Nero M，Santos SS，Leao MV,etal．Effectiveness of three instrumentation systems to remove Enterocoeeus faecalis from root canals [J]．IntEndodJ，2012，45(5)：435-438.

[14]郭晓琳，彭伟，鲁丽珍，等.临床常用根管预备器械清洁能力的扫描电镜观察 [J]. 牙体牙髓牙周病学杂志，2013，23(9)：595-598，601.

[15]Pataky L，lvanyi I，Grigar A，etal．Antimicrobial efficacy of various root canal preparation techniques：An in vitro comparative study [J]．JEndod，2002，28(8)：603-605.

[16]Dalton BC，Orstavik D，Phillips C，etal．Bacterial reduction with nickel titanium rotary instrumentation [J]．JEndod，1998，24(11)：763-767.

[17]Coldero LG，Mcttugh S，MacKenzie D，etal．Reduction in intracanal bacteria during root canal preparation with and without apical enlargement [J]．IntEndodJ，2002，35(5)：437-446.

Antibacterial efficacy of mechanical preparation and diode laser onenterococcusfaecalisin vitro

LI Ya- nan*, CHE Xiao- qian, WANG Hong- wei, LI Ru, SUN Hui- bin

(*DepartmentofStomatology,AffiliatedhospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266100,China)

AIM: To evaluate the antibacterial efficacy of mechanical preparation and diode laser onenterococcusfaecalisin infected root canals in vitro. METHODS: 50 single-rooted teeth of in vitro root canalenterococcusfaecalisinfection model were randomly divided into 5 groups (n=10). The root canals of the teeth in the control group were prepared by Protaper F3. After F3 preparation, the tooth canals in the other 4 groups were treated with diode laser for 10 s and 20 s with 1.0 W or 2.0 W, respectively. Microbiological samples were collected from the root canals before and after irrigation. The dentin debris from two depths of the root canals were collected and cultured for turbidimetric count. A one- way ANOVA with the Tukey Test was conducted for the comparisons among the groups. RESULTS: The numbers ofE.faecalisin all the groups decreased after treatment (P<0.05). The bacterieidal ration (BR) of the treatment groups was higher than that of the control(P<0.05). Between each 2 laser groups,P>0.05. The number ofE.faecalisfrom two different depths of dentin reduced in all the laser groups(P<0.05). Under the condition of 10 s jrradiation, the disinfection was more effective with 2.0 W than that with 1.0 W, and there was no significant difference between 10 s irradiation and 20 s irradiation under the conditions of 2.0 W irradiation. With 1.0 W the disinfection was more effective by 20 s irradiation than by 10 s, and with 2.0 W there was no significant difference between 10 s and 20 s irradiation. CONCLUSION: Diode laser is effective on root canal disinfection due to its effective penetration in dentins. The bactericidal effect enhances with increase of irradiation time and energy.

enterococcus faecalis; diode laser; root canal treatment; bactericidal ratio

2015-02-05

青岛大学附属医院青年科研基金

李亚男(1988-)，女，汉族，山东济南人。硕士生(导师：孙慧斌)

孙慧斌，E-mail：shb353.qindao@163.com

R780.2

A

1005-2593(2015)08-0483-05