复方菖蒲益智汤对脑缺血再灌注损伤小鼠小胶质细胞的影响

臧春柳 田军彪 崔 媛 徐丽娟 刘学飞 赵见文 (河北省唐县中医院，河北 唐县 0750)

脑缺血后的炎症反应以外周白细胞浸润和小胶质细胞激活为特征。激活的小胶质细胞通过与神经细胞直接接触，发挥脑内吞噬细胞的作用，以及释放和(或)分泌一系列神经毒性物质、炎症因子、免疫应答分子等产生细胞毒性效应，加重脑缺血再灌注损伤。前期研究已证实化浊解毒活血通络法可通过抑制脑缺血再灌注损伤小鼠炎症因子的释放从而降低脑缺血再灌注的损伤程度〔1〕。复方菖蒲益智汤是在化浊解毒活血通络法的基础上通过临床应用筛选出的固定方药。本研究观察复方菖蒲益智汤对脑缺血再灌注损伤小鼠小胶质细胞的影响，进一步探讨化浊解毒活血通络法防治脑缺血再灌注损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级健康雄性昆明小鼠50只，体重22～25 g，河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证号:1202160。

1.2药品、试剂及实验仪器 复方菖蒲益智汤(成年人用量):赤芍 15 g、石菖蒲 15 g、黄连6 g、郁金15 g、川芎9 g、丹参15 g、当归9 g、茯苓15 g、泽泻6 g、益智仁15 g、地龙15 g等，方中各药材均一次性购买于河北省中医院。尼莫地平片，批号:国药准字H10910040，规格为20mg，由天津市中央药业有限公司提供。CD11b试剂盒，石家庄长江生物实验科技开发有限公司提供。实验仪器主要有电子天平、高性能无菌实验台、显微图像分析系统等。

1.3动物分组、模型制备及给药方法 采用随机数字表法将50只昆明小鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组，复方菖蒲益智汤高剂量组、复方菖蒲益智汤低剂量组，每组10只。采用阻断双侧颈总动脉法制备脑缺血再灌注模型。用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，颈前正中切口，分离双侧颈总动脉，用微型动脉夹夹闭双侧颈总动脉10 min，再灌注10 min，如此反复3次，形成不完全性全脑缺血再灌注模型。假手术组只分离颈总动脉，不夹闭，余步骤同上。术中及术后2 h用白炽灯保持小鼠肛温37℃左右。

术后2 h动物完全清醒后参照文献〔2〕采用“5分法”对小鼠脑缺血再灌注模型进行神经行为学评分。0分，无神经缺损症状;1分，轻度局灶性神经功能缺失(不能完全伸展瘫痪侧前肢);2分，重度局灶性神经功能缺失(爬行时向瘫痪侧转圈);3分，中度局灶性神经功能缺失(行走时向瘫痪侧倾倒);4分，不能自发行走，意识水平降低;5分，死亡。1～3分为有效模型。死亡或不符合条件者予以剔除，并遵循随机原则补齐动物。

造模成功后第二天开始给药，假手术组、模型组分别每日一次灌服生理盐水20 ml/kg，复方菖蒲益智汤高剂量组、低剂量组分别每日一次灌服复方菖蒲益智汤17.55、8.78 ml/kg，尼莫地平组灌服尼莫地平0.78 mg/ml。连用14 d。

1.4标本处理 各组小鼠按规定时间治疗结束后迅速断头取脑，去除嗅球、小脑及低位脑干，10%多聚甲醛溶液固定24 h，常规石蜡包埋。自视交叉处开始向后做连续冠状的组织切片，片厚约 5 μm。

1.5CD11b免疫组化染色 石蜡切片经二甲苯脱蜡及系列酒精脱水，在清水中冲洗后加入3%H2O2去离子水孵育5～10 min，PBS冲洗，3 min×3次。滴加山羊血清工作液，室温孵育10 ～15 min，倾去，滴加1∶50 的一抗(兔抗 Cd11b)，37℃孵育2～3 h，PBS冲洗，3 min×3次。滴加生物素二抗工作液，室温孵育10～15 min，PBS冲洗，3 min×3次。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育10～15 min，PBS冲洗，3 min×3次。DAB染色，自来水充分冲洗，浸泡于苏木精溶液中染色，脱水，透明，封片剂封片。每组随机选取5张切片，每张切片在400倍光学显微镜下随机选取5个完整但不完全重叠的视野观察，胞质内有棕黄色或棕褐色颗粒者为蛋白表达阳性细胞，利用图像分析系统测定阳性细胞的平均光密度值(OD值)，反映切片上阳性细胞免疫组化染色的强弱。

1.6统计分析 使用SPSS13.0软件，实验数据以s表示，多组间比较采用单因素方差分析。两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1各组小鼠小胶质细胞的表达水平 小胶质细胞阳性染色呈棕黄色或棕褐色，不均匀地分布于胞质、胞核及细胞周围，呈椭圆形或不规则形。模型组阳性细胞表达(0.312±0.006)较假手术组(0.165±0.006)明显增多(P＜0.05)。与模型组相比，各给药组阳性细胞表达均明显降低(P＜0.05)。复方菖蒲益智汤高剂量组阳性细胞表达(0.181±0.005)比复方菖蒲益智汤低剂量组(0.242±0.003)、尼莫地平组(0.241±0.003)明显减少(P＜0.05)，与假手术组比较无明显差异(P＞0.05)。复方菖蒲益智汤低剂量组、尼莫地平组间无明显差异(P＞0.05)。见图1。

2.2神经功能缺损评分 术后24 h:与假手术组相比，各组小鼠的神经行为学评分显著升高(P＜0.05)，模型组、中药高剂量组、中药低剂量组、尼莫地平组小鼠行为学评分无明显差异(P＞0.05)。药物干预14 d，中药高剂量组、中药低剂量组、尼莫地平组小鼠行为学评分明显低于模型组(P＜0.05)，中药高剂量组小鼠的神经行为学评分低于中药低剂量组、尼莫地平组(P＜0.05)，中药低剂量组与尼莫地平组小鼠的神经行为学评分无明显差异(P＞0.05)。见表1。

表1 各组小鼠神经功能缺损评分比较(x ± s，n=10)

图1 各组小鼠脑组织小胶质细胞的形态学变化(×400)

3 讨论

中医对中风痰瘀致病学说在历代医学文献中均有论述:《素问·生气通天论》曰:“阳气者，大怒则形气绝，而血菀于上，使人薄厥”，指出中风与瘀血密切相关。朱丹溪《丹溪心法》曰:“中风大率主血虚有痰，治痰为先，次养血行血”;“痰挟瘀血，遂成窼巢”，首次提出痰瘀同病，并提出治痰为先。由此可见历代医家对中风痰瘀致病学说有了深入的认识，并指出痰瘀互结是中风的病理基础。

受诸多医家痰瘀致病学说的影响，并根据多年临床经验，导师认为中风的主要发病机制为“浊凝清窍，瘀损脑络”，并制定了化浊解毒活血通络法，通过临床应用筛选出固定方药复方菖蒲益智汤。石菖蒲芳香走窜，宣窍豁痰，辟秽化浊。黄连大苦大寒，燥湿去浊，降火解毒。郁金为入血分之气药，清气化痰，凉血破瘀。三者合而为君。地龙为虫类之品，性善走串，有通络之功。赤芍、丹参性味苦寒凉血逐瘀，当归活血行气，共行臣药之职。泽泻渗湿泄热，引邪从小便而出。云苓性味甘淡，健脾去湿。益智仁温脾暖肾，使痰浊生化无源，为佐药。川芎上行头目，行气活血，引诸药上行为方中之使。诸药合用，共奏化浊解毒活血通络之效。现代药理研究，川芎提取物川芎挥发油、川芎嗪对脑缺血再灌注小鼠具有清除自由基〔3〕，抑制神经细胞凋亡〔4〕的作用。丹参提取物丹参酮 B钠盐通过降低MCAO模型大鼠谷氨酸、减少海马不同亚区NMDAR1通道蛋白的表达而起到神经保护作用〔5〕，丹参酮ⅡA能减小鼠缺血再灌注诱导的脑梗死体积，降低凋亡相关基因Bcl-2和caspase-3表达〔6〕，对抗脑缺血再灌注损伤。益智仁水提取物显著降低脑缺血大鼠海马NO含量及NOS活力，提高脑缺血大鼠的学习记忆能力，有明显的神经保护作用〔7〕。

小胶质细胞是一类广泛分布于中枢神经系统的胶质细胞，对神经元的生理活动起着支持、营养、保护及修复等重要作用，是目前公认的参与中枢神经系统免疫反应的主要效应细胞，相当于外周组织中的巨噬细胞，具有对组织损伤和感染做出快速反应的能力，构成中枢神经系统抵御病原体入侵的第一道免疫防线。作为中枢神经系统对损伤反应和免疫防护的标志物，小胶质细胞在缺血性脑卒中病程中发挥着重要作用。脑缺血缺氧引起小胶质细胞迅速激活。实验研究发现小胶质细胞的过度激活可以通过核因子(NF)-κB通路诱导神经炎症，促进肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、IL-18、IL-6 等前炎性细胞因子的生成〔8～10〕，加重神经元损伤和凋亡;但同时也可以产生兴奋性氨基酸、NO、大量的超氧阴离子、花生四烯酸衍生物以及其他一些潜在的神经毒素，导致神经元死亡，从而加重中枢神经系统的病理损伤。

本研究结果显示复方菖蒲益智汤高剂量对脑缺血再灌注损伤小鼠有明显的神经保护作用，其作用机制可能与抑制小胶质细胞的表达水平、拮抗小胶质细胞引发的一系列损伤有关。

1 赵见文，田军彪，张颜伟，等.化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤小鼠血清IL-6和TNF-α水平的影响〔J〕.国际中医中药杂志，2011;33(7):594-6.

2 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral ar-tery occlusion without craniotomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20(1):84-91.

3 阮 琴.川芎挥发油川芎嗪对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕.浙江中医杂志，2009;44(9):642-3.

4 赵秋振，刘玉利，张 辉.川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注海马神经元Bax mRNA表达的影响〔J〕.时珍国医国药，2011;22(2):435-6.

5 蔡 青，黄淑芸，谭俊珍，等.丹参酮B钠盐对脑缺血再灌注损伤大鼠海马不同亚区NMDARl蛋白表达的影响〔J〕.中国中西医结合杂志，2012;32(8):1703-4.

6 李 浩，刘开祥，俸军林，等.丹参酮ⅡA对鼠脑缺血再灌注损伤模型Bcl-2和caspase-3表达的影响〔J〕.中国康复医学杂志，2008;15(6):442.

7 嵇志红，于新宇，陈 旭.益智仁水提取物对脑缺血大鼠记忆障碍的改善作用〔J〕.中华行为医学与脑科学杂志，2009;18(7):580-2.

8 Smith JA，Das A，Ray SK，et al.Role of pro-inflammatory cytokines released from microglia in neurodegenerative diseases〔J〕.Brain Res Bull，2012;87(1):10-20.

9 Magni P，Ruscica M，Dozio E，et al.Parthenolide inhibits the LPS-induced secretion of IL-6 and TNF-alpha and NF-kappaB nuclear translocation in BV-2 microglia〔J〕.Phytother Res，2012;26:1405-9.

10 Zhang G，He JL，Xie XY，et al.LPS-induced iNOS expression in N9 microglial cells is suppressed by geniposide via ERK，p38 and nuclear factor-kappaB signaling pathways〔J〕.Int J Mol Med，2012;30(4):561-8.