某医院2012－2013年242株肺炎克雷伯菌β－内酰胺酶及整合子耐药基因检测

郭 普，贺晓珊，梅传忠，李兴武，刘双成，沈继龙

2.蚌埠医学院医学检验系，蚌埠 233003；

3.安徽病原生物学省级实验室和人兽共患病安徽省重点实验室，安徽医科大学病原学教研室，合肥 230032

肺炎克雷伯菌是医院感染重要的条件致病菌，常引起肺炎、尿路感染、脑膜炎、败血症等[1－2]。近年来，由肺炎克雷伯菌引起的医院感染不断增多，尤其在ICU，已成为常见的医院感染病原菌，特别是目前大剂量广谱抗菌药物的广泛应用甚至滥用，使得该菌的多重耐药现象日趋严重，给临床治疗带来极大的困难。为了解我院肺炎克雷伯菌的耐药特性及耐药基因分布情况，笔者对我院2012年1月至2013年5月分离的肺炎克雷伯菌进行了β－内酰胺酶及整合子耐药基因检测并进行耐药分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株 收集2012年1月－2013年5月蚌埠医学院第一附属医院临床分离的肺炎克雷伯菌242株（去除同一患者同一部位的重复菌株），其中来自痰标本 104株 （42.98%）、创面分泌物70株（28.93%）、尿液24株（9.29%）、全血和骨髓24株（9.29%）、其它标本20株（8.26%）。标本的采集、送检、处理依据第3版《全国临床检验操作规程》。

1.2 仪器及试剂 VITEK 2－compact全自动细菌鉴定药敏系统：法国梅里埃公司生产；PCR扩增仪：德国Biomera产品；电泳仪：美国Bio－Rad公司产品。细菌鉴定及药敏试验卡为仪器原装配套产品，EX－taq聚合酶和DNA分子量标准均为大连宝生物公司产品。质控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603，大肠埃希菌ATCC25922购自卫生部临检中心。阳性对照的 TEM、SHV、OXA－10、KPC－gp、KPC－qc、DHA、intI－1、intI－2、intI－3产酶菌株由安徽医科大学第一附属医院沈继录博士惠赠。

1.3 细菌鉴定和药敏实验 所有细菌的鉴定和药敏实验采用法国的VITEK 2－compact全自动细菌鉴定药敏分析系统。

1.4 PCR扩增和序列分析

1.4.1 引物设计及合成 根据GenBank公布的blaTEM、blaSHV、blaOXA－10、KPC－gp、KPC－qc、DHA、intI－1、intI－2、intI－3 的 DNA 序 列，使 用Prime Premier 5.0软件设计引物，引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列及退火温度、产物大小见表1。

表1 各基因型片段引物序列、退火温度及产物长度Tab.1 Primer sequences，annealing temperature and products size of the genotypes

1.4.2 PCR扩增 PCR反应体积为50μL，反应体系：EX Taq酶0.5μL、10×PCR 缓冲液 （含Mg2＋）5μL、dNTP混合物4μL、模板DNA 3μL、上下游引物各1μL（10μm／μL）、超纯水补足至50 μL。反应条件：94。C预变性7min，94。C40s、63。C 40s、72。C40s、30个循环，72。C10min、4。C保温。同时设阳性对照及阴性对照，将扩增片段进行凝胶电泳、成像。

2 结 果

2.1 感染部位 242株肺炎克雷伯菌主要来自呼吸道标本和手术切口为主，分别占42.98%和28.93%。

2.2 感染病区分布 242株肺炎克雷伯菌在ICU分离率最高，其次为急诊外科，分别为30.17%和7.02%，其在不同科室的具体分布见表2。

表2 242株肺炎克雷伯菌临床科室分布Tab.2 Distribution of 242 Klebsiella pneumonia strains isolated from clincal departments.

2.2 药敏分析 242株肺炎克雷伯菌对16种抗生素存在不同程度的耐药，其中氨曲南、头孢唑啉、氨苄西林／舒巴坦、头孢曲松和头孢他啶耐药率较高，耐药率分别为76.86%、65.70%、63.64%、62.40%和59.92%，对亚胺培南、丁胺卡那、厄他培南和哌拉西林／他唑巴坦较为敏感，耐药率分别为：17.77%、18.88%、18.88%、和23.55%。见表3。

2.3 耐药基因检测 β－内酰胺酶耐药基因中ESBLs基因阳性155株，占64.05%，主要为TEM型和SHV型，两者同时存在的菌株有114株，占产ESBLs基因菌株的 73.55%（114／155）。其次为KPC基因86株，占35.54%；AmpC基因43株，占17.77%，全部为DHA型。整合子基因128株，占52.89%，以整合子1（intI－1）为主，共检出120株，占49.59%。基因分布见表4。部分PCR扩增结果的电泳图片见图1。

表3 242株肺炎克雷伯菌对16种抗生素耐药率Tab.3 Drug－resistant rate of 242 Klebsiella pneumonia strains against 16kinds of antibiotics

表4 242株肺炎克雷伯菌的耐药基因分布Tab.4 Drug－resistant gene distribution of 242 Klebsiella pneumonia strains

图1 DHA和intI1耐药基因PCR扩增结果Fig.1 PCR analysis of DHA genotype and intI1

3 讨 论

肺炎克雷伯菌是导致医院感染常见和重要的条件致病菌，近年来，随着新型广谱抗菌药物在临床广泛使用，各种侵入性诊疗活动的增加，肺炎克雷伯菌在临床的感染率及对多种抗生素的耐药率呈逐渐上升的趋势，部分菌株甚至对高效、广谱的亚胺培南等碳青霉烯类抗生素也产生了耐药性，出现了多重耐药甚至泛耐药菌株，给临床治疗带来极大的挑战[3－5]。肺炎克雷伯菌可引起医院感染的暴发流行。目前国内外都有引起暴发流行的相关报道[6－8]，Snitkin.ES等报道美国国立卫生研究院临床中心发生了碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌引起医院感染的暴发流行，国内张晓芸等也报道了泛耐药肺炎克雷伯菌引起ICU医院感染的暴发流行。因此，对肺炎克雷伯菌耐药菌株的耐药机制进行检测，明确其耐药特性，以指导临床合理用药，减少耐药发生，预防医院感染的暴发流行成为迫切需要解决的问题。

本研究结果显示，我院肺炎克雷伯菌的感染主要分布在ICU、外科病区及呼吸病科，感染部位以呼吸道感染为主占42.98%，其次为手术切口占28.93%，与相关报道相近[1]。ICU 及呼吸病科收治的患者大多在严重的基础病、自身免疫水平低下、长期大量使用多种抗生素、住院时间长，气管切开、气管插管、呼吸机的使用等侵入性诊疗操作较多，破坏了机体的防御屏障，使得呼吸道分泌功能减弱，导致肺炎克雷伯菌的感染率高于其它病区。外科手术病区也常易受该菌的感染。值得关注的是该菌曾多次短时间内在ICU同一病区、同一病房内发生感染，均为泛耐药菌，鉴定号也相同，说明引起感染的细菌可能来自同一克隆，有引起医院感染暴发流行的倾向。

从药敏结果看，242株肺炎克雷伯菌对16种抗生素存在不同程度的耐药，其中β－内酰胺类抗生素氨曲南、头孢唑啉、氨苄西林／舒巴坦、头孢曲松和头孢他啶耐药率较高，耐药率都高于60.00%，碳青霉烯类抗生素亚胺培南、厄他培南耐药率也分别达到了17.77%、18.18%，周荣[1]等研究发现 2008－2011年重庆医科大学第一附属医院分离的855株肺炎克雷伯菌对β－内酰胺类抗生素耐药率除头孢唑林其余均低于50.00%，亚胺培南和厄他培南耐药率仅为6.30%、4.20%。2012年中国CHINET报道[2]肺炎克雷伯菌对β－内酰胺类抗生素耐药率14.1%～53.7%，亚胺培南和厄他培南耐药率为8.90%、12.90%，均略低于我院耐药结果。文献报道，产ESBLs、KPC、AmpC等β－内酰胺酶是肺炎克雷伯菌对β－内酰胺类抗生素主要耐药机制之一[9－10]。本研究发现242株耐药菌株中 ESBLs基因阳性155株，占64.05%；其次为KPC基因86株，占35.54%；AmpC基因43株，占17.77%，全部为DHA基因。在ESBLs基因中主要为TEM型和SHV型，与蔡俊、雷金娥和Freitas F等报道结果相近[9－11]。本组细菌中整合子基因阳性的有128株，占52.89%，以整合子1（intI－1）为主，共检出120株，占49.59%，略低于毛璞等报道的结果57.91%[12]。整合子属可移动的基因元件，能位于细菌的质粒和染色体上，在细菌耐药及耐药基因的水平传播中具有重要的意义，且一个整合子可捕获多个耐药基因盒，表达对不同抗生素的耐药性。我院分离的多重耐药的肺炎克雷伯菌对β－内酰胺类及含酶抑制剂的抗生素耐药率高，除了和产生各种β－内酰胺酶、整合子的水平传播有关，可能还存在高表达的外排泵系统、外膜蛋白的丢失等其他耐药机制，有待于进一步研究。此外，本组细菌对氨基糖苷类、氟喹诺酮类的抗生素耐药率也高于50.00%，具体耐药机制也有待于进一步研究。本组肺炎克雷伯菌亚胺培南、丁胺卡那、厄他培南和哌拉西林／他唑巴坦较为敏感，耐药率均小于30.00%，可以作为经验性治疗选药。

综上所述，我院肺炎克雷伯菌对多种抗生素耐药率高，耐药机制复杂，临床应根据药敏结果规范合理使用抗生素，同时加强医院感染的监控，以减少耐药菌株的产生和播散。

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