鸵鸟源鼠隐孢子虫虫种鉴定及动物感染试验研究

齐 萌，刘利敏，黄 磊，徐利纳，张素梅，张龙现

隐孢子虫病（Cryptosporidiosis）是由隐孢子虫（Cryptosporidium）引起的一种重要的机会性人兽共患原虫病，为全球性重要的食源性／水源性疾病之一[1]。隐孢子虫已公认的有效种有27个，多数种类具有宿主特异性，其中鼠隐孢子虫（Cryptosporidiummuris）为人兽共患虫种，主要寄生于啮齿类动物胃腺粘膜上皮细胞，包括人在内的其他多种哺乳动物也有感染报道[1－4]。禽类中，曾有报道在茶色蟆口鸱和夜鹰粪便中检测到C.muris，但是否为粪便被C.muris卵囊污染尚不确定[5]。也有调查在蛇类粪便中检测到C.muris和泰泽隐孢子虫（Cryptosporidiumtyzzeri），调查者认为该两种隐孢子虫并非寄生于蛇消化道上皮细胞，而是蛇摄食隐孢子虫阳性的啮齿类动物，卵囊通过粪便排出体外[6－7]。

非洲鸵鸟属鸟纲鸵形目鸵鸟科，是现存体型最大的平胸鸟类，其主要感染贝氏隐孢子虫（Cryptosporidiumbaileyi）、火鸡隐孢子虫（Cryptosporidiummeleagridis）、隐孢子虫禽基因型II（avian genotype II）和一个隐孢子虫未定种[8－9]。目前已有的研究发现C.muris仅感染哺乳动物，本研究从非洲鸵鸟粪便中分离到一种隐孢子虫卵囊，经形态学观察和分子生物学鉴定为C.muris。为了解鸵鸟源C.muris传播能力及生物学特征，本试验用鸵鸟源C.muris接种罗曼雏鸡、Balb／c鼠和蒙古沙鼠，观察动物感染后临床症状和排卵囊规律，通过组织学观察其宿主适应性和寄生部位等方面，以期为隐孢子虫的分类地位及生物学特性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 卵囊来源C.muris卵囊分离自郑州某鸵鸟养殖场10岁以上长期排卵囊的鸵鸟。

1.1.2 试验动物与分组 购自郑州牧业工程高等专科学校孵化场1日龄罗曼雏鸡20只，10只为感染组，10只为不感染对照组；购自河南省试验动物中心20日龄Balb／c鼠15只，10只为感染组，5只为不感染对照组；购自首都医科大学15只20日龄蒙古沙鼠，10只为感染组，5只为不感染对照组。各试验动物均于感染前连续粪检3d，无肠道寄生虫感染者用于本试验。感染组动物每只接种卵囊剂量为1.0×106个／mL，不感染对照组每只经口灌胃等体积蒸馏水。动物接种卵囊后每天收集粪便检查卵囊。

1.1.3 动物组织样品 感染成功的动物于排卵囊高峰期分别剖杀，取其胃、十二指肠和空肠组织样品，光镜样品置10%中性福尔马林固定液中，常温保存备用，电镜样品保存于pH＝7.2的2.5%戊二醛溶液中固定，置4。C冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 卵囊检查 采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法检查卵囊，用微分干涉差显微镜进行拍照。

1.2.2 卵囊收集与计数 采用不连续蔗糖密度梯度离心法收集卵囊。用血细胞计数板进行卵囊计数，计算每克粪便中的隐孢子虫卵囊数（OPG）。

1.2.3 DNA提取 采用日本TOYOBO公司生产的Mag Extractor－Genome提取试剂盒 （购自北京夏斯生物技术有限公司），按照其说明书提取流程进行操作。

1.2.4 PCR扩增 18SrRNA基因引物设计和反应程序参照Xiao等[10]的报道，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.5 测序 由北京诺赛基因有限公司完成。

1.2.6 组织样品观察 光镜样品按常规石蜡组织切片样品处理方法脱水、HE染色、显微镜观察照相；电镜样品按常规扫描电镜样品处理方法脱水、置换乙醇、干燥和喷金，观察照相。

2 结 果

2.1C.muris形态学观察 饱和蔗糖溶液中卵囊呈长椭圆形，淡蓝色，卵囊周围显黄绿色，部分卵囊囊壁凹陷。微分干涉差显微镜下，卵囊呈卵圆形或近圆形，测量76个卵囊，平均卵囊大小为（7.41±0.12）μm×（5.70±0.07）μm，卵囊指数为1.30。见图1。

图1 微分干涉显微镜下的鼠隐孢子虫卵囊 （比例尺：10 μm）Fig.1 Cryptosporidium muris oocysts under differential interference contrast microscopy（Scale bars：10μm）

2.2 18SrRNA基因的PCR扩增和测序 PCR成功扩增出隐孢子虫分离株的18SrRNA基因片段，大小为830～850bp。将PCR进行测序，对其序列进行Clustalx比对，与C.muris同源性为100%，鉴定出该隐孢子虫分离株为C.muris。该序列GenBank登录号为GQ227706。

2.3 动物感染试验 雏鸡接种鸵鸟源C.muris30d内，各组雏鸡均无C.muris卵囊排出，精神状态始终良好，剖检其胃肠道均正常。C.muris卵囊经灌胃接种Balb／c鼠，从感染后第9 d（9days post infection，DPI 9）有卵囊排出至DPI 46结束。潜隐期为8d，显露期为37d。排卵囊高峰期在DPI 17－DPI 31，最大 OPG为20.5×104个。感染组与不感染对照组小鼠均无死亡，粪便性状、食欲、毛质和精神状况良好。详见图2。

图2 Balb／c鼠感染鼠隐孢子虫排卵囊规律Fig.2 Development of oocysts shedding of Balb／c mice after inoculation with C.muris oocysts

C.muris卵囊接种蒙古沙鼠后，潜隐期为13 d，DPI 13发现卵囊排出，沙鼠持续排出卵囊时间至DPI 85结束，显露期72d，排卵囊高峰期在DPI 31－DPI 64，最大OPG为41.5×104个。试验前后，感染组与不感染对照组蒙古沙鼠均无死亡，粪便性状、食欲、毛质和精神状况良好。

2.4 组织粘膜涂片改良抗酸染色观察 分别在Balb／c鼠和蒙古沙鼠感染隐孢子虫排卵囊高峰期，各剖杀两只，取胃肠道粘膜涂片，采用改良抗酸染色法进行观察，十二指肠、空肠、回肠、结肠和直肠各肠道粘膜涂片中均未发现C.muris卵囊，仅在鼠胃粘膜涂片中发现C.muris卵囊。在1 000倍光学显微镜下观察，卵囊在蓝绿色背景下呈玫瑰红色，对比明显。见图3。

图3 经改良抗酸染色法染色后的鼠胃粘膜涂片中鼠隐孢子虫卵囊（1 000×）Fig.3 C.muris oocyst in the mice gastric gland stained by modified acid fast stain（1 000×）

2.5 病理组织学观察 剖检可见，感染组Balb／c鼠和蒙古沙鼠的胃和对照组相比，均萎缩变小，内容物少，胃壁变薄。通过对组织切片HE染色观察，结果在胃腺小凹发现大量C.muris虫体寄生，在胃腺内，可观察到C.muris各发育阶段，肠道组织内未发现虫体，见图4。对照组未见异常。

2.6 电子扫描显微镜观察 取感染组Balb／c鼠胃组织进行电镜观察，在5 000倍扫描电镜下，胃腺部位发现大量各阶段C.muris虫体寄生，带虫空泡嵌在胃腺粘膜内，虫体在带虫空泡内发育，Ⅰ型裂殖体8个裂殖子清晰可见，见图5。

3 讨 论

3.1 鸵鸟自然感染的隐孢子虫虫种 1994年，Gajadhar[11]报道鸵鸟可感染隐孢子虫，显微镜观察其卵囊形态不同于C.baileyi和C.meleagridis，分离的隐孢子虫卵囊不能感染乳鼠、雏鸡、火鸡和鹌鹑，提出该鸵鸟源隐孢子虫可能是一个新种。2006年，Meireles等[12]报道其发现的鸵鸟隐孢子虫分离株与C.baileyi分子遗传特征有差异，但需对其卵囊的形态特征和生物学特性进行研究以确定其是否为新的隐孢子虫种类／基因型。国内，孙铭飞等[13]对鸵鸟源隐孢子虫分离株进行生物学特性研究，结果显示获得的分离株均为C.baileyi，可感染雏鸡和幼龄鸵鸟，但不能感染小鼠，主要寄生部位为泄殖腔和法氏囊。Wang等[14]报道郑州地区鸵鸟隐孢子虫感染率为11.7%，主要感染6月龄以下鸵鸟，基于18srRNA基因对53个隐孢子虫分离株进行鉴定，均为C.baileyi。本研究从形态学观察，分子生物学方法和动物感染试验证明分离的鸵鸟源隐孢子虫为C.muris，且长期排卵囊，其在鸵鸟体内的寄生部位有待于进一步研究。

3.2C.muris人兽共患性C.muris具有较为广泛的宿主谱，可感染人、小鼠、仓鼠、松鼠、田鼠、岩狸、双峰驼、野生白山羊、犬、猫、山狗、非洲蹄兔、短尾猴和猪等多种哺乳动物，在肯尼亚、泰国、法国、秘鲁、印度尼西亚和埃及等国的免疫力低下人群中及健康人群中均有感染C.muris的报道[1－4]。先前研究认为，C.muris只感染哺乳动物，禽类曾有报道粪便中发现C.muris，但不清楚是否为通过卵囊机械传播造成的[5]。基于多位点序列分型（MLST），本研究中的鸵鸟源C.muris亚型结构（M5、M4、M6、M4）显著不同于来自于捷克共和国、肯尼亚、埃及、秘鲁、日本和中国的多种人源／动物源C.muris亚型结构，表明鼠隐孢子虫与宿主存在共进化，其人兽共患性经长期宿主适应存在协同进化[15－16]。

图4 蒙古沙鼠胃腺中鼠隐孢子虫各阶段虫体形态（1 000×）Fig.4 Morphological characterization of C.muris developed in Mongolian gerbils gastric gland（1 000×）

图5 扫描电镜观察Balb／c鼠胃腺寄生的鼠隐孢子虫（5 000×）Fig.5 C.muris developed in Balb／c mice gastric gland observed by SEM （5 000×）

3.3C.muris动物感染试验C.muris由Tyzzer于1907年首次在试验鼠胃内发现并命名，随后研究发现C.muris所有发育阶段均在胃腺完成[17]。日本研究人员先后用家鼠源C.muris分离株（RN66株）进行动物感染试验，但结果存在较大差异。1989年，Iseki[18]等报道 RN66株卵囊感染小鼠、猫、豚鼠、兔子和犬，试验动物个体接种卵囊量均为1.0×106个，卵囊接种3周龄的SPF小鼠后，潜隐期为5 d，显露期为DPI 34－75，高峰期为DPI 16－26，在高峰期每只小鼠每天排卵囊量达11×106～46×106个，寄生部位为胃腺。1999年，Taylor等[19]等分别用400个、2.0×104个和1.0×106个 RN66株卵囊感染6周龄小鼠，卵囊潜隐期为10～18d，排卵囊持续至DPI 89，不同剂量感染组小鼠均未表现临床症状，感染组小鼠和不感染对照组体重变化无统计学差异；剖检可见，胃腺肿大增生，充血，组织学观察发现虫体寄生于胃腺，细胞坏死，粘膜固有层嗜酸性粒细胞浸润、变形。2001年，Toshihiro等[20]用低剂量RN66株卵囊对3周龄ICR小鼠进行感染试验，25只小鼠接种24个卵囊，仅1只发现有卵囊排出，潜隐期为21d；25只小鼠接种240个卵囊，19只感染成功，潜隐期为14～17d；50只小鼠每天接种24个卵囊，连续接种10d，4只感染成功，潜隐期为14－19d；而5只接种2.4×106个卵囊的小鼠均感染成功，潜隐期为6～7d。上述研究表明，使用同一个C.muris分离株进行动物感染试验，不同的试验动物和不同的感染量均可使其感染力、潜隐期及显露期不同。

不同C.muris分离株存在宿主特异性。自然条件下，野生田鼠可感染C.muris，然而 Modry等[21]用C.muris卵囊人工接种5种田鼠，每只接种1.0×105个卵囊，结果发现均不感染。同样，非人灵长类可自然感染C.muris，而近来一个研究发现，免疫力正常和免疫抑制的食蟹猴接种1.0×107个 RN66株卵囊，均未发现感染。Kvac等[23－24]人工感染试验显示，家鼠源C.muris不能感染8周龄仔猪，但可感染蒙古沙鼠，接种7日龄和8周龄蒙古沙鼠，每只接种1.0×106个卵囊，潜隐期分别为18d和21d，前者显露期大于90d，排卵囊最大OPG值为12×106，后者显露期为93～100d，个体每日排卵囊最大OPG值为1.7×106，试验过程中，均未出现临床症状。Melicherova等[25]用两种实验鼠对C.muris进行了生活史研究，分别接种Balb／c鼠和白鼻乳鼠1.0×108个C.muris分离株（TS03株），两者潜隐期和显露期存在较大差异，Balb／c鼠潜隐期和显露期分别为7.5～10d和10～15d，而白鼻乳鼠潜隐期长达18～21d，显露期呈慢性长期感染。内生发育过程研究显示，两种实验鼠均于接种C.muris卵囊后5d形成厚壁形卵囊，在Balb／c鼠胃内薄壁型卵囊和卵囊最早形成于DPI 5和DPI 7.5，而显著不同的是，在白鼻乳鼠胃内薄壁型卵囊和卵囊最早形成于DPI 14和DPI 18，进一步表明不同源C.muris分离株存在宿主差异并与宿主共进化。

本试验采用鸵鸟源C.muris感染雏鸡、Balb／c鼠和蒙古沙鼠，感染量均为1.0×106个卵囊，发现雏鸡不能感染C.muris，Balb／c鼠和蒙古沙鼠均可感染成功。其中Balb／c鼠感染C.muris卵囊后，潜隐期8d，显露期37d，排卵囊高峰期在DPI 17－DPI 31；蒙古沙鼠的潜隐期为12d，显露期72d，排卵囊高峰期在DPI 31－DPI 64；两种实验鼠的感染差异同Melicherova等[25]的研究，但接种鸵鸟源C.muris分离株的Balb／c鼠显露期明显长于接种TS03株的Balb／c鼠，表明鸵鸟源C.muris分离株与TS03株存在不同感染情况。本试验中感染成功的动物试验前后精神状态良好，无临床症状，组织学和电镜扫描观察，仅在胃内发现大量C.muris虫体寄生，并可见其各发育阶段，与前人研究相一致。结果表明鸵鸟源C.muris与鼠源C.muris感染实验鼠后在其排卵囊规律各有差异，临床表现、寄生部位、内生发育过程相同，存在人兽共患风险，但其如何寄生于鸵鸟及其在鸵鸟体内寄生部位和繁殖发育阶段有待进一步研究。

[1]Xiao L.Molecular epidemiology of cryptosporidiosis：An update[J].Exp Parasitol，2010，124（1）：80－89.DOI：10.1016／j.exppara.2009.03.018

[2]Ren X，Zhao J，Zhang L，et al.Cryptosporidiumtyzzerin.sp.（Apicomplexa：Cryptosporidiidae）in domestic mice（Musmusculus）[J].Exp Parasitol，2012，130（3）：274－281.DOI：10.1016／j.exppara.2011.07.012

[3]Kvac M，Hofmannova L，Hlaskova L，et al.Cryptosporidium erinacein.sp.（Apicomplexa：Cryptosporidiidae）in hedgehogs[J].Vet Parasitol，2014，201（1－2）：9－17.DOI：10.1016／j.vetpar.2014.01.014

[4]Pavlasek I，Ryan U.The first finding of a natural infection ofCryptosporidiummurisin a cat[J].Vet Parasitol，2007，144（3－4）：349－352.

[5]Ng J，Pavlasek I，Ryan U.Identification of novelCryptosporidiumgenotypes from avian hosts[J].Appl Environ Microbiol，2006，72（12）：7548－7553.

[6]Richter B，Nedorost N，Maderner A，et al.Detection ofCryptosporidiumspecies in feces or gastric contents from snakes and lizards as determined by polymerase chain reaction analysis and partial sequencing of the 18Sribosomal RNA gene[J].J Vet Diagn Invest， 2011， 23 （3）： 430－435. DOI： 10.1177／1040638711403415

[7]da Silva DC，Paiva PR，Nakamura AA，et al.The detection ofCryptosporidiumserpentisin snake fecal samples by real－time PCR[J].Vet Parasitol，2014，204（3－4）：134－138.DOI：10.1016／j.vetpar.2014.05.012

[8]Fayer R.Taxonomy and species delimitation inCryptosporidium[J].Exp Parasitol，2010，124（1）：90－97.DOI：10.1016／j.exppara.2009.03.005

[9]Nguyen ST，Fukuda Y，Tada C，et al.Prevalence and molecular characterization ofCryptosporidiumin ostriches（Struthiocamelus）on a farm in central Vietnam[J].Exp Parasitol，2013，133（1）：8－11.DOI：10.1016／j.exppara.2012.10.010

[10]Xiao L，Escalante H，Yang CF，et al.Phylogenetic analysis ofCryptosporidiumparasites based on the small－subunit rRNA gene locus[J].Appl Environ Microbiol，1999，65（4）：1578－1583.

[11]Gajadhar AA.Host specificity studies and oocyst description of aCryptosporidiumsp.isolated from ostriches[J].Parasitol Res，1994，80（4）：316－319.

[12]Meireles MV，Soares RM，dos Santos MM，et al.Biological studies and molecular characterization of aCryptosporidiumisolate from ostriches（Struthiocamelus）[J].J Parasitol，2006，92（3）：623－626.

[13]Sun MF，Zhang LX，Ning CS，et al.Identification ofCryptosporidaisolate from ostrich in China and biological characters studies[J].Sci Agric Sin，2007，40（7）：1528－1534.（in Chinese）孙铭飞，张龙现，宁长申，等.鸵鸟源隐孢子虫的种类鉴定及其生物学特性研究[J].中国农业科学，2007，40（7）：1528－1534.

[14]Wang R，Qi M，Jingjing Z，et al.Prevalence ofCryptosporidiumbaileyiin ostriches（Struthiocamelus）in Zhengzhou，China[J].Vet Parasitol，2011，175（1／2）：151－154.DOI：10.1016／j.vetpar.2010.10.005

[15]Feng Y，Yang W，Ryan U，et al.Development of a multilocus sequence tool for typingCryptosporidiummurisandCryptosporidiumandersoni[J].J Clin Microbiol，2011，49（1）：34－41.DOI：10.1128／JCM.01329－10

[16]Wang R，Jian F，Zhang L，et al.Multilocus sequence subtyping and genetic structure ofCryptosporidiummurisandCryptosporidiumandersoni[J].PLoS One，2012，7（8）：e43782.DOI：10.1371／journal.pone.0043782

[17]Tyzzer E.An extracelluar coccidium，Cryptosporidiummurisof the gastric glands of the common mouse[J].Med Res，1910，18：487－509.

[18]Iseki M，Maekawa T，Moriya K，et al.Infectivity ofCryptosporidiummuris（strain RN 66）in various laboratory animals[J].Parasitol Res，1989，75（3）：218－222.

[19]Taylor MA，Marshall RN，Green JA，et al.The pathogenesis of experimental infections ofCryptosporidiummuris（strain RN 66）in outbred nude mice[J].Vet Parasitol，1999，86（1）：41－48.

[20]Mstsue T，Fujino T，Kajima J，et al.Infectivity and oocyst excretion patterns ofCryptosporidiummurisin slightly infected mice[J].J Vet Med Sci，2001，63（3）：319－320.

[21]Modry D，Hofmannova L，Antalova Z，et al.Variability in susceptibility of voles（Arvicolinae）to experimental infection withCryptosporidiummurisandCryptosporidiumandersoni[J].Parasitol Res，2012，111（1）：471－473.DOI：10.1007／s00436－012－2821－1

[22]Masuno K，Fukuda Y，Kubo M，et al.Infectivity ofCryptosporidiumandersoniandCryptosporidiummuristo normal and immunosuppressive cynomolgus monkeys[J].J Vet Med Sci，2014，76（2）：169－172.

[23]Kvac M，Kestranova M，Kvetonova D，et al.Cryptosporidium tyzzeriandCryptosporidiummurisoriginated from wild West－European house mice（Mus musculus domesticus）and East－European house mice（Musmusculusmusculus）are non－infectious for pigs[J].Exp Parasitol，2012，131（1）：107－110.DOI：10.1016／j.exppara.2012.03.016

[24]Kvac M，Sak B，Kvetonova D，et al.Infectivity of gastric and intestinalCryptosporidiumspecies in immunocompetent Mongolian gerbils （Merionesunguiculatus）[J].Vet Parasitol，2009，163（1－2）：33－38.DOI：10.1016／j.vetpar.2009.03.047

[25]Melicherova J，Ilgova J，Kvac M，et al.Life cycle ofCryptosporidiummurisin two rodents with different responses to parasitization[J].Parasitology，2014，141（2）：287－303.DOI：10.1017／S0031182013001637