冠心病患者血浆中microRNA-145表达与冠状动脉侧支循环形成的相关性研究

唐义信 孙权 朱灵萍 童霄羽 罗瑛

冠状动脉侧支循环（coronarycollateral circulation，CCC）的建立是心肌在长期、反复缺血基础上形成的一种代偿机制。建立良好的CCC可以在一定程度上增加冠状动脉血流储备，缩小急性心肌梗死的面积，降低急性冠状动脉事件后的死亡率，减少室壁瘤的形成，改善心室功能，有益于冠心病患者的预后[1]。然而，目前对CCC的形成机制尚不清楚。大量研究表明，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,ⅤEGF）、成纤维生长因子（fibroblast growth factor，FGF）、血小板衍生生长因子（platelet-derivedgrowth factor，PDGF）等参与了 CCC的形成。其中ⅤEGF通过FLT-1和FLT-KDR受体直接作用于血管内皮细胞，刺激其增殖、迁移、小管形成[2]，具有强大的促血管生成作用。MicroRNA-145（miRNA-145）与血管生成相关，在代谢综合征的大鼠模型中通过调节血管平滑肌细胞的表型改变参与CCC的形成[3]。此外，ⅤEGF也是miRNA-145的靶基因，因此探讨miRNA-145和ⅤEGF在CCC中表达水平及其相关性，有助于进一步揭示CCC形成的机制。

1 对象和方法

1.1 研究对象

入选2012年3月至2014年3月在中南大学湘雅医院心导管室接受选择性冠状动脉造影（CAG）检查的冠心病患者80例，其中男性53例，女性27例。 年龄51～78岁，平均（63.8±4.7）岁。

入选标准：左前降支（left anterior descending，LAD）、左回旋支（left circumflex artery，LCX）、右冠状动脉（right coronary artery，RCA）三支主要冠状动脉中至少一支直径狭窄≥90%，其中一支病变、两支病变、三支病变分别为20例（25.0%），17例（21.3%），43 例（53.8%）。

排除标准：（1）年龄 ＜18岁、＞90 岁；（2）既往曾接受过支架置入术或冠状动脉旁路移植治疗；（3）近3个月发生过急性心肌梗死；（4）合并先天性冠状动脉畸形；（5）合并瓣膜性心脏病；（6）合并感染、肿瘤或结缔组织疾病者；（7）合并肝、肾功能不全或外周血管疾病者。

征得患者知情同意后，详细采集相关临床资料，包括年龄、性别、血压、心率、吸烟史、高血压史、糖尿病史、血脂异常及用药情况。

1.2 冠状动脉造影方法

冠状动脉造影在Philips HC5000型心血管专用X光机上进行。采用Judkin法行选择性左、右冠状动脉造影，行多角度投照体位判断冠状动脉狭窄程度。每个投照体位采集3～5个以上心动周期影像，以确保冠状动脉清晰及侧支血管成像。评价冠状动脉狭窄程度均由两位经验丰富的心血管介入医师阅片后取平均值，如两位医师判断结果存在较大差异时，再请第3位经验丰富介入医师商讨后再计算冠状动脉的狭窄程度。

1.3 评分标准

1.3.1 冠状动脉病变程度评价 根据冠状动脉造影结果，采用公认Gensini积分方法[4]评价冠状动脉病变程度。冠状动脉狭窄程度分为25%、50%、75%、90%、99%和100%。其中狭窄 ＜25%定义为1分，25% ～49%定义为2分，50%～74%定义为4分，75% ～89%定义为8分，90%～99%定义为16分，100%定义为32分。不同节段冠状动脉评分系数严格按照Gensini标准执行。每例患者冠状动脉病变程度的最终积分为三支主要分支的积分之和。

1.3.2 CCC形成程度评价 按照Rentrop分级方法[5]对CCC进行分级。0级：不能观察到任何侧支循环通道的充盈；1级：可见侧支循环充盈病变血管的分支，但不能充盈心外膜下血管段；2级：侧支循环充盈部分心外膜下血管段；3级：侧支循环充盈整个心外膜下血管段。

1.4 血浆样本的收集

患者行冠状动脉造影术前，从桡动脉血管鞘内抽取动脉血5 ml，迅速转入EDTA采血管中，在室温下静置 15～30 min后，3 000 r/min（离心半径：10 cm）离心10 min，取血浆分装于EP管中，-80℃冰箱保存待用。

1.5 血浆中miRNA-145的提取

取上述血浆样本，每份 400 μL，按 Trizol（TaKaRa，中国大连）试剂盒说明书提供的方法提取总 RNA。RNA溶于20 μL DEPC处理过的水中，4℃过夜后测定其水平，并电泳检测 RNA完整性。血浆中miRNA-145的表达采用realtime PCR方法测定。每个待测样取500 ng总RNA，利用反转录试剂盒（TaKaRa，中国大连）合成cDNA，稀释 4倍后取2 μL作为 real-time PCR的模板。利用ABI7500 real-time PCR仪检测血浆中miRNA-145表达，反应体系和程序设置均参考real-time试剂盒（TaKaRa，中国大连）说明书。内参基因U6和目的基因miRNA-145的反转录引物和real-time引物均购自广州锐博生物科技有限公司。Real-time PCR结果分析采用2-ΔΔCt法。

1.6 血浆中ⅤEGF水平的测定

血浆中ⅤEGF的测定采用ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司），操作步骤参考说明书。每个样品均设置3个复孔，最后记录450 nm的OD值，用于绘制标准曲线和计算待测样品水平。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 基线临床资料比较

如表1所示，各组患者在年龄、性别、血压、心率、吸烟史、血脂异常、高血压史、糖尿病史、心肌梗死病史及用药情况比较差异无统计学意义，证明各组间存在可比性。且随着CCC分级的升高，Gensini积分也随之升高，其中 CCC 2级和3级组的Gensini积分明显高于 CCC 0级组（P＜0.05或 P＜0.01）。

2.2 不同 CCC组患者血浆中 ⅤEGF水平及miRNA-145相对表达比较

单因素方差分析发现，不同CCC组患者血浆中ⅤEGF水平及miRNA-145相对表达差异均有统计学意义（P＜0.01）；通过LSD-t检验进行组间两两比较发现，上述两个指标的差异均有统计学意义（P＜0.01），见表 2。

2.3 血浆中ⅤEGF水平和miRNA-145相对表达水平与CCC相关性分析

如图1、2所示，采用Pearson相关分析发现严重冠心病患者的血浆中ⅤEGF水平与患者的CCC分级呈明显的正相关（r=0.672，P ＜0.01）；血浆中miRNA-145相对表达水平与患者的CCC分级呈明显的负相关（r=-0.761，P ＜0.01）。

2.4 血浆中ⅤEGF水平与miRNA-145相对表达水平相关性分析

通过生物信息学分析，我们发现ⅤEGF 3′UTR存在miRNA-145的结合位点（图3A），因此我们分析了不同CCC组血浆中ⅤEGF水平与miRNA-145相对表达水平的相关性。结果表明，不同CCC组血浆中ⅤEGF水平与miRNA-145相对表达水平呈明显负相关（r=-0.529，P ＜0.01，图3B）。

2.5 miRNA-145相对表达水平、血浆ⅤEGF水平与CCC分级的相关性

以冠状动脉CCC分级为因变量，血浆ⅤEGF水平与miRNA-145相对表达水平为自变量，构建多元线性回归分析模型，分析miRNA-145相对表达水平或血浆ⅤEGF水平与CCC分级间单独的相关关系。如表3结果所示，控制血浆ⅤEGF水平后，miRNA-145相对表达水平与患者的CCC分级呈明显的负相关（r=-0.669，P ＜0.01）；控制 miRNA-145相对表达水平后，血浆ⅤEGF水平与患者的CCC分级呈明显的正相关（r=0.524，P ＜0.01）。

表1 不同CCC分级组患者基线临床资料比较

表2 不同CCC分级组患者血浆中ⅤEGF及miRNA-145相对表达水平比较（）

表2 不同CCC分级组患者血浆中ⅤEGF及miRNA-145相对表达水平比较（）

CCC分级 例数 ⅤEGF（ng/L） miRNA-145 0级 24 100.3± 6.0 0.75±0.11 1级 19 109.7±12.4 0.66±0.13 2级 20 120.8±14.0 0.58±0.09 3级 17 131.7±19.5 0.40±0.09 F值 20.88 37.9 P值 0.001 0.001

图1 冠心病患者血浆ⅤEGF水平与CCC分级相关性分析

图2 冠心病患者血浆miRNA-145相对表达水平与CCC分级相关性分析

图3 冠心病患者血浆ⅤEGF水平与miRNA-145相对表达水平相关性分析（n=80）

表3 CCC分级的多元线性回归分析结果

3 讨论

Merenich等[6]在1956年发现正常心脏冠状动脉之间存在侧支通道，其直径为20～350 μm，长度为1～5 cm，但这些通道无论形态上还是功能上都不成熟，不具备动脉血管的结构与功能。当冠状动脉严重狭窄病变或闭塞时，在压力阶差和细胞因子的刺激下冠状动脉之间不成熟的侧支通道逐渐发育成熟的CCC，良好的CCC的建立直接影响到冠心病患者的预后。本研究通过观察不同CCC组患者血浆中ⅤEGF水平及 miRNA-145相对表达，结果发现：（1）随着CCC分级的增加，血浆中ⅤEGF水平亦随之升高，血浆中miRNA-145相对表达随之下降；（2）血浆中 ⅤEGF水平与 CCC的建立呈正相关，miRNA-145相对表达与CCC呈负相关，且miRNA-145与ⅤEGF呈负相关。

ⅤEGF是一种促进血管内皮细胞增殖和血管生成的细胞因子，通过与受体的结合从而诱导多种细胞反应，包括促进细胞的增殖、迁移、血管新生及抑制细胞凋亡等[7]。近年来大量的研究发现ⅤEGF在CCC的形成中起重要作用，血浆中ⅤEGF水平与CCC的形成呈正相关[8]。同时也有研究发现，在正常的动物模型中给予ⅤEGF能促进CCC的形成，而予以ⅤEGF抑制剂能抑制CCC的形成，表明ⅤEGF是CCC形成必不可少的细胞因子[9]。本研究发现血浆中ⅤEGF水平CCC分级的增加而升高，不同CCC组之间差异明显，且ⅤEGF水平与CCC的建立呈正相关，与Matsunaga等[10]的研究结果相一致，可能与机体缺血缺氧后，诱导ⅤEGF产生，通过与受体相结合刺激多种信号通路，促进CCC的形成。

miRNA是一类在翻译水平上调控基因表达的小分子非编码RNA，研究发现有一些miRNA参与血管生成，如 miRNA-216、miRNA-21、miRNA-145等。本研究中，随着 CCC分级的增加，血浆中miRNA-145相对表达随之下降，且CCC的形成呈负相关。因此推测，miRNA-145可能通过影响其下游靶基因如ⅤEGF的表达参与CCC的形成。同时通过生物信息学分析发现，ⅤEGF 3′UTR区存在miRNA-145的结合位点，而已有研究也表明miRNA-145可以通过抑制ⅤEGF的表达参与血管的新生及血管平滑肌细胞表型的改变[11-12]。同时分析了不同CCC组间血浆中miRNA-145表达水平及ⅤEGF水平相关性，发现在不同CCC组间两者呈负相关，表明miRNA-145通过调控ⅤEGF的表达参与CCC的建立。

总之，CCC的形成机制极其复杂，深入探讨对冠心病的预后具有重要临床意义。本研究提示，在CCC形成中，miRNA-145发挥着重要作用，可能通过调控ⅤEGF的表达参与CCC的建立。但本研究由于样本量小，其确切的机制有待进一步研究。