拟南芥CAS基因的生物信息学分析及超表达载体构建

余璐璐，阳敦润，曹中权，刘龙山，罗 璐，徐 飞*，

（武汉生物工程学院 a.应用生物技术研究中心；b.生命科学与技术学院，湖北 武汉 430415）

拟南芥CAS基因的生物信息学分析及超表达载体构建

余璐璐a，阳敦润b，曹中权b，刘龙山b，罗 璐b，徐 飞*a，b

（武汉生物工程学院 a.应用生物技术研究中心；b.生命科学与技术学院，湖北 武汉 430415）

对拟南芥氰丙氨酸合酶（cyanoalanine synthase，CAS）基因进行了生物信息学分析，并构建了CAS合酶基因的超表达载体，以期为其后续功能研究奠定基础。生物信息学分析结果表明，编码拟南芥CAS合酶的CYS-C1和CYS-D1基因均含有10个外显子和9个内含子，定位于3号染色体，而CYS-D2基因有9个外显子和8个内含子，定位于5号染色体；3个基因编码的蛋白氨基酸序列相似度较高，CYS-C1蛋白偏碱性且主要在线粒体中起作用，而CYS-D1和CYS-D2蛋白偏酸性，主要在细胞质中起作用。通过RT-PCR扩增了拟南芥CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2基因片段，并构建了超表达载体pBI121-35S-CYS-C1、pBI121-35S-CYS-D1和pBI121-35S-CYS-D2，经检测重组质粒已转化到农杆菌GV3101中。

拟南芥；氰丙氨酸合酶（CAS）；超表达载体；生物信息学

氰丙氨酸合酶（cyanoalanine synthase，CAS）是植物解氰作用的关键酶［1］，其底物之一氰化氢（hydrogen cyanide，HCN）是植物体内广为存在的一种内源性小分子类代谢产物。HCN可抑制线粒体呼吸链中的细胞色素c氧化酶的活性，因而HCN对于生物体来说有很强的毒性［2-5］。但值得关注的是，植物具有产HCN并耐HCN的特性。以往的研究者分析一方面是因为植物体内存在一条由交替氧化酶（alternative oxidase，AOX）介导的抗氰呼吸途径（cyanide-resistance respiration pathway），可减轻HCN对呼吸链的抑制作用［3-4］；另一方面，HCN会诱导CAS合酶的活性，从而可将HCN降低到安全浓度范围内［5-6］。

有研究表明拟南芥中存在CYS-C1（At3g61440）、CYS-D1（At3g04940）和CYS-D2（At5g28020）3个编码CAS合酶蛋白的基因，其中CYS-C1基因表达量最多［7］。从作用部位来看，CYS-C1蛋白在线粒体中表达，而CYS-D1和CYS-D2蛋白在细胞质中表达［8］。值得关注的是，HCN伴随乙烯的合成发生在细胞质中［5］，但分解HCN的CAS合酶主要存在于线粒体，这一重要结论暗示CAS合酶的作用很可能是为了减轻HCN对线粒体呼吸链的抑制，而非彻底清除HCN。此外，近年来还有研究表明，植物细胞能利用内源HCN调控一些重要的生理过程，如种子萌发［9］、开花诱导［10］等，同时在植物抗虫抗病反应过程中也有重要作用［11-12］。因此，植物在解HCN与利用内源HCN存在一个平衡机制，关键在于对不同时期和部位CAS活性的调控。但是，植物调控CAS活性的机理仍不明确，尤其是在植物响应逆境胁迫反应的过程中。

因此，笔者试图通过生物信息学的方法分析拟南芥CAS基因的结构特点、氨基酸的组成、蛋白的亚细胞定位及时空表达模式，并构建CAS基因的超表达载体，为今后进一步研究CAS基因家族成员的功能及对植物细胞内源性HCN的调控机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 拟南芥CAS基因生物信息学分析

拟南芥CAS基因结构利用在线分析工具Gene Structure Display Server（GSDS，http：//gsds1.cbi.pku.edu. cn/index.php）进行分析；基因染色体定位利用NCBI数据库的Mapviewer进行了在线分析；氨基酸序列分析及同源进化树构建分别利用Vector NTI 11.5和MEGA 5.2软件进行分析；CAS基因家族亚细胞定位和蛋白成员理化性质分析分别使用WolfPSORT（http：//psort.hgc.jp/）和ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）进行预测分析；拟南芥CAS基因的时空表达模式则利用Genevestigator进行在线分析。

1.2 拟南芥CAS基因超表达载体构建

1.2.1 试验材料 拟南芥种子（野生型，Col）购自ABRC（Arabidopsis Biological Resource Center）种子库。拟南芥种子用清水浸种1 d，然后用0.1 mol/L KMnO4消毒5 min后播种在含营养土和蛭石（1：1）的培养基质上，同时施以1/2 Hoagland营养液。培养30 d后幼苗用于实验。

1.2.2 拟南芥总RNA的提取及质量检测 拟南芥总RNA的提取采用Trizol（Invitrogen公司）试剂。RNA的完整性及其纯度分别通过1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计（TU-1800）测定OD260/OD280的光密度比值进行检测分析。

1.2.3 CAS基因的克隆及质粒DNA（pBI121）的提取 将mRNA通过反转录试剂盒（Fermentas公司）合成第一链cDNA后，利用设计的特异性引物（见表1）进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；接下来是35个扩增循环；94℃变性50 s；49℃退火45 s；72℃引物延伸1 min 30 s；最后在72℃条件下反应10 min，终止反应。将产物纯化回收后送往上海生工生物工程有限公司进行基因测序。pBI121质粒DNA的提取参照质粒提取试剂盒（Takara公司）完成。提取后的质粒DNA保存于-20℃冰箱备用。

表1 基因扩增引物列表Tab.1 Primers used for genes amplification

1.2.4 重组质粒的构建 用BamH I和SmaI对目的基因和表达载体pBI121分别进行双酶切，回收目的片段后，用T4 DNA连接酶进行连接反应。连接后的载体分别命名为pBI121-35S-CYS-C1、pBI121-35SCYS-C2和pBI121-35S-CYS-D2。载体构建如图1所示。

图1 CAS基因超表达载体构建示意图Fig.1 Schematic diagrams ofCASgenes over-expression vectors

1.2.5 重组质粒的转化与鉴定 将重组质粒转化到农杆菌GV3101感受态细胞中，并在含100 μg/mL Kana抗生素的平板上（28℃）培养2 d后筛选阳性克隆。挑选阳性单克隆菌落用YEB摇菌培养12 h后，取菌液并提取质粒进行PCR检测分析。

2 结果与分析

2.1 拟南芥CAS基因生物信息学分析

2.1.1 拟南芥CAS基因结构分析 利用在线分析工具Gene Structure Display Server（GSDS，http：//gsds1. cbi.pku.edu.cn/index.php）对拟南芥CAS基因结构进行分析，结果如图2所示，CYS-C1和CYS-D1基因有10个外显子和9个内含子，CYS-D2基因有9个外显子和8个内含子。

图2 拟南芥CAS基因结构分析Fig.2 CASgenes structure analysis ofarabidopsis

2.1.2 拟南芥CAS基因的染色体定位分析 为进一步了解拟南芥CAS基因在染色体上的定位，利用NCBI数据库的Mapviewer进行了在线分析，结果如表2和图3所示。从图3中可以看出，拟南芥CYS-C1和CYS-D1基因定位于3号染色体，CYS-D2基因定位于5号染色体。

表2 拟南芥CAS基因的染色体定位信息Tab.2 Locus information ofCASgene family inarabidopsischromosome

图3 拟南芥CAS基因的染色体定位图谱Fig.3 Mapview ofCASgenes families inarabidopsischromosome

2.1.3 拟南芥CAS基因同源比对及进化树构建 利用Vector NTI 11.5软件对CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2蛋白氨基酸序列进行了比对分析表明，CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2的氨基酸序列相似度较高，尤其是在97～128、200～250和302～348区间（见图4）。

图4 拟南芥CAS基因家族氨基酸序列比对结果Fig.4 Blast results ofCASgenes inarabidopsis

此外，从NCBI找到已知CAS基因序列的物种，并与拟南芥CAS基因家族蛋白进行同源比对后，利用MEGA5.2软件构建的系统进化树（见图5）。由图5可以看出，拟南芥CYS-C1与黄瓜的亲缘关系较近，而CYS-D1和CYS-D2与盐芥的亲缘关系较近。

2.1.4 拟南芥CAS基因的亚细胞定位预测分析 拟南芥CAS基因家族亚细胞定位使用WolfPSORT（http：//psort.hgc.jp/）进行预测。结果如图6所示，拟南芥CYS-C1蛋白定位于线粒体，而CYS-D1和CYS-D2蛋白主要定位于细胞质，其次是定位于过氧化物酶体。这些结果表明CYS-C1蛋白应该是参与保护线粒体呼吸链（减轻HCN对呼吸链的抑制），CYS-D1蛋白和CYS-D2蛋白可能是代谢HCN（使其降低至安全浓度范围内）。

2.1.5 拟南芥CAS家族成员蛋白的理化性质分析 使用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）对拟南芥CAS家族成员蛋白进行了理化性质分析，结果见表3。从3表中可以看出，拟南芥CAS家族成员蛋白大小相差不大，其中最大的CYS-C1蛋白氨基酸长度为368，分子量为39.93 ku。从理论等电点数据来看，CYS-C1蛋白偏碱性（PI=8.71），而CYS-D1（PI=5.23）和CYS-D2（PI=5.74）蛋白偏酸性。此外，蛋白不稳定性分析显示，拟南芥CAS家族成员蛋白的不稳定指数在20～33之间，未超过临界值（大于40被认为不稳定），表明CAS家族成员蛋白稳定性较好。其次，从表3中所显示各成员的平均亲水性来看，CYS-C1和CYS-D1的亲水性为负值，表明均是亲水性蛋白，即可溶性蛋白。CYS-D2的亲水性值为0.079，表明其是疏水性蛋白，不过数值并不太高，推测其应是微溶于水。

图5 CAS基因的同源进化树分析Fig.5 Phylogenetic analysis ofCASgenes

图6 拟南芥CAS基因的亚细胞定位分析Fig.6 Subcellular locus analysis ofCASgenes inarabidopsis

表3 拟南芥CAS家族成员蛋白理化性质分析Tab.3 Analysis on physical and chemical properties ofCASgenes families inarabidopsis

2.1.6 拟南芥CAS基因的时空表达模式分析 利用Genevestigator在线分析拟南芥CAS基因的时空表达模式。如图7所示，拟南芥CYS-C1基因在萌芽和生长、发育阶段表达量均较高。相比之下，CYS-D1和CYS-D2的表达量相当，且在拟南芥种子成熟以前均低于CYS-C1基因的表达。在种子成熟时期，3个基因的表达量均明显下降，且几乎处于同一水平。

图7 拟南芥CAS基因的时空表达模式Fig.7 CASgenes expression of different stage inarabidopsis

2.2 拟南芥CAS基因的超表达载体构建

2.2.1 拟南芥CAS基因的克隆及pBI121质粒DNA的提取 结果见图8，从图8（a）可以看出，本实验提取的RNA质量较好，电泳条带清晰；紫外分光光度计测定后计算RNA的光密度比值OD260/OD280=1.92，表明提取的RNA无杂蛋白污染。图8（b）显示RT-PCR扩增的基因条带清晰，特异性强。PCR产物回收后进行基因检测可知CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2基因分别为1 200、1 070和970 bp大小的片段。此外，从图8（c）可以看出，pBI121质粒DNA提取质量较好，无明显蛋白质等杂质污染。

图8 拟南芥CAS基因的扩增及质粒DNA的提取Fig.8 CASgenes amplification and pBI121 plasmid DNA extraction inarabidopsis

2.2.2 重组质粒的构建及筛选鉴定 菌液用于重组质粒鉴定，检测结果如图9中（a）～（c）所示，重组质粒pBI121-35S-CYS-C1、pBI121-35S-CYS-D1和pBI121-35S-CYS-D1均扩增出了与目的基因相同大小的片段，表明挑选的菌斑均为阳性克隆。

此外，将重组质粒进行琼脂糖凝胶电泳后显示，重组质粒明显大于pBI121空质粒（见图9（d）），从而进一步表明CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2基因已成功连接至pBI121表达载体中。

图9 重组质粒的鉴定Fig.9 Identification of recombinant plasmids

3 讨论

氰化物可抑制细胞色素氧化酶的活性，从而抑制线粒体呼吸作用。尽管植物线粒体呼吸链中存在一条抗氰呼吸途径，但植物细胞不能长期适应高浓度内源氰化物的存在，因此解氰作用对于植物细胞维持正常物质和能量代谢，有着重要的意义［3］。

近年来，国内外的研究发现氰化物在种子萌发［9］、植物抗病［12-14］等反应中起重要作用，这表明植物在解氰与利用内源氰化物之间存在着某种平衡机制，但植物调控CAS合酶活性的机理仍不明确。笔者通过生物信息学研究发现，拟南芥CAS基因家族成员表达量和亚细胞分布不尽相同。CYS-C1基因表达量最多，蛋白偏碱性（PI=8.71），为亲水性蛋白；CYS-D1和CYS-D2基因表达量较少，蛋白均偏酸性，其中CYS-D1为亲水性蛋白，CYS-D2为疏水性蛋白。从蛋白作用部位来看，CYS-C1作用部位为线粒体，而CYS-D1和CYS-D2作用部位主要为细胞质。这些结果表明，CYS-C1在减轻氰化物（尤其是HCN）对线粒体呼吸链的抑制作用中扮演主要角色。

HCN伴随乙烯的合成发生在细胞质［15］，但解氰作用的CAS合酶主要存在于线粒体（CYS-C1），这也再次表明CAS的活性应是保护线粒体呼吸链的正常运转，而非彻底清除HCN（细胞质中的CYS-D1和CYS-D2表达量较少），细胞质中残留的低浓度HCN应该是促进种子萌发和增强植物抗病的关键因素之一。因此，笔者通过构建CAS基因超表达载体，以期进一步研究CAS基因的功能。经菌液PCR和质粒大小分析，本实验已成功构建了CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2基因的超表达载体pBI121-35S-CYS-C1、pBI121-35S-CYS-D1和pBI121-35S-CYS-D2。实验中所用的质粒载体pBI121具有在真核生物中高表达的启动子CaM35S和易检测的报告基因GUS。将目的基因连接在GUS基因前面，使其在植物中整合表达，便于今后对基因进行准确的亚细胞定位，及时空表达研究检测分析。此外，拟南芥CAS家族3个基因的重组质粒已成功转化到农杆菌GV3101中，这为后续基因功能的相关研究奠定了基础。

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（责任编辑：胡燕梅）

Bioinformatics Analysis and Over-Expression Vectors Construction ofCASGenes in Arabidopsis

YU Lulua，YANG Dunrunb，CAO Zhongquanb，LIU Longshanb，LUO Lub，XU Fei*a，b
（a.Center of Applied Biotechnology；b.College of Life Science and Biotechnology，Wuhan Bioengineering Institute，Wuhan 430415，Hubei，China）

TheCASgenes were analyzed by bioinformatics methods and over-expression vectors ofCAS genes were constructed.Bioinformatics analysis show thatCYS-C1andCYS-D1have ten exons and nine introns，whileCYS-D2has nine exons and eight intron.CYS-C1andCYS-D1locate at chromosome 3 whileCYS-D2locates at chromosome 5.Furthermore，the amino acid sequences ofCASgenes share a high similarity.However，CYS-C1is basic protein and functions at mitochondria，whereasCYS-D1and CYS-D2are acidic protein and function at cytoplasm.The over-expression vectors of pBI121-35SCYS-C1，pBI121-35S-CYS-D1and pBI121-35S-CYS-D2were constructed，and the recombinant plasmids were transformed into agrobacterium GV3101.

arabidopsis；cyanoalanine synthase（CAS）；over-expression vector；bioinformatics

Q71；Q782

A

1673-0143（2015）02-0150-08

10.16389/j.cnki.cn42-1737/n.2015.02.010

2014-11-13

国家自然科学基金项目（31400242）；武汉生物工程学院应用校本研究项目（2014K29）

余璐璐（1984—），女，助教，硕士，研究方向：植物生理生态。

*通讯作者：徐 飞（1985—），男，讲师，博士，研究方向：植物生理与分子生物学。Email∶feixu666@hotmail.com