M48磁珠法提取脱落细胞DNA的改良方法

1.晋江市公安局物证鉴定室 2.浙江省台州市公安司法鉴定中心 3.泉州市公安局物证鉴定所

王 芳 1 李 达 2 程 冲 3 刘 超 1

随着犯罪分子反侦察手段的提高，在犯罪现场提取到指掌纹和肉眼可见的生物物证概率不断降低，但是来自人体正常新陈代谢过程中的脱落细胞，由于肉眼不可见，常常被犯罪分子忽略掉，因此，如何成功、快速地检验出犯罪嫌疑人在现场遗留的脱落细胞 DNA就成为破案的一个新手段。日常检案中，大部分地区均采用M48磁珠法提取DNA[1-2]，常规M48磁珠法提取DNA步骤较为繁琐，耗时较长，而本文采用改良M48磁珠法进行DNA提取，可以缩短提取时间，并能保证提取质量。

1 材料与方法

1.1 材料

实验选用的50例烟蒂、50例作案工具（螺丝刀柄、匕首柄、老虎钳柄）、50例纺织品（手套、衣服等）均为案件物证，烟蒂用直接剪取后备检，纺织品用脱落细胞粘取器粘取后备检，作案工具用干湿两步擦拭法擦拭后备检。

50例烟蒂、50例作案工具、50例纺织品的每个样品各选取 2份，分别用常规 M48磁珠法和优化后的磁珠法提取DNA，然后用9700扩增（体系为10μL），AB公司的3130型遗传分析仪进行测序。

1.2 方法

1.2.1 常规M48磁珠法

取检材放入1.5mL离心管中，加入190μL缓冲液G2，加入10μL蛋白酶 K，漩涡振荡 10秒，56℃孵育 2小时，13000rpm离心5分钟，转移200μL上清液到1.5mL样品管中，按文献[2]中M48法提取纯化上清液DNA，4℃保存备用扩增。

1.2.2 改良的M48磁珠法

取检材放入1.5mL离心管中，加入190μL缓冲液G2，加入10μL蛋白酶K，漩涡振荡10秒，56℃孵育2小时（特殊检材延长孵育时间），13000rpm离心5分钟，转移200μL上清液到1.5mL样品管中，在样品管中加入 MTL，MTL：样品溶液=3∶1，加入30μL磁珠（若碰到极微量物证，可加入1μL的载体RNA），充分混匀溶液，用摇匀仪摇15分钟，混匀后将样品管放在磁力架上，使磁力架和样品颠倒 2、3次，一一打开样品管盖，用双手夹紧样品管，快速垂直倾倒溶液（可一次性倒出 6个样品管内溶液），用吸瓶加入约500mL 75%乙醇溶液，摇匀样品溶液，将样品管放在磁力架上，使磁力架和样品颠倒2～3次，一一打开样品管盖，用双手夹紧样品管，快速垂直倾倒溶液，此洗涤过程重复2次，最后一遍洗涤后应去除所有洗涤液，将样品管放入恒温仪65℃恒温10分钟，加入30μL去离子水，65℃恒温10分钟，期间振荡2～3次，最后13000rpm离心3分钟，4℃保存备用扩增。

1.2.3 方法比较

改良后的M48磁珠法省略了MW1溶液及一次酒精洗涤过程，使用快速倾倒溶液法及用吸瓶加液法。

2 结果

常规和改良的M48磁珠法提取三种脱落细胞DNA，STR检验成功数无显著性差异，如图1所示。

图1 二种方法提取三种脱落细胞DNA STR检验成功数

常规和改良的M48磁珠法提取三种脱落细胞DNA，获得的STR分型无显著性差异。一起盗窃案件现场手套采用二种方法提取DNA结果见图2、图3。

常规M48磁珠法提取纯化DNA的时间平均44m/个，而改良的M48磁珠法提取纯化DNA的时间平均38m/个。

图2 一起盗窃案件现场手套用常规M48磁珠法提取DNA的STR图谱

图3 一起盗窃案件现场手套用改良的M48磁珠法提取DNA的STR图谱

3 讨论

M48磁珠法是利用细胞裂解液促使细胞膜、核膜发生变化，获得DNA片段后，通过磁珠作载体在MTL环境中结合DNA，而杂质不被磁珠吸附或结合，然后利用磁力架聚集磁珠，杂质在浓度80%的乙醇三次洗涤过程中吸弃，最后通过洗脱程序，将磁珠上吸附的 DNA释放于水中。而在基层检验中，浓度75%的乙醇洗涤两次已足够去除杂质，无需再加入MW1及三次乙醇洗涤，且乙醇的量无需固定500mL，只要能覆盖吸附在磁力架上的磁珠就行，使用快速倾倒溶液法及用吸瓶加溶液法都大大减少了提取时间，而最后使用13000rpm离心沉淀磁珠，没有转移样品管过程中的损耗，也避免了两次污染，对DNA的回收率高[2]。

综上，本文实验结果显示，采用改良的M48磁珠法提取纯化DNA，不仅为基层办案赢得宝贵时间，同时在一定程度上减轻DNA检验人员的工作量，并能保证提取质量。

[1]王彦涛,宋道江.M48磁珠法和Chelex-100提取脱落DNA的初步比较[J].刑事技术, 2013（2）：53-54.

[2]杨电,张丽萍,刘超,等.Chelex-100和两种磁珠法提取接触性DNA效果的比较[J].刑事技术, 2012（1）：11-13.