直扩法检验新鲜烟蒂DNA的最佳检验部位

莆田市公安局物证鉴定所 丛雪尘 方爱琼 方 茜

Identifiler Plus试剂盒在产品定位上虽不属于直扩试剂盒，但因其具有抗抑制能力强等特点，也具有直扩的潜力。关于 Identifiler Plus应用于不同类型的现场检材直扩检验的可行性和有效性，已经有文献予以报道，用其对现场血样进行直扩检验的成功率和用 Identifiler-Direct进行直扩检验的成功率无显著差异，用其对现场烟蒂及擦拭物进行直扩检验的成功率甚至远远高于用 Identifiler-Direct进行直扩检验的成功率[1]，这进一步表明Identifiler Plus应用于直扩时表现良好。对于烟蒂的 DNA检验，有研究指出，当烟蒂放置时间超过一周时，检出率就将随着放置时间的增长而大幅下降，且在用Chelex-100方法提取烟蒂DNA时，提取烟纸上DNA的检出率要大大高于提取海绵上DNA的检出率[2]，而在烟纸中加入海绵对检出率没有显著影响[3]。笔者认为，该结论是否同样适用于直扩法还需进一步验证，且该验证非常有必要，因为这对日常检案将带来很大帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

50个烟蒂均来源于志愿者，为新鲜烟蒂。

1.2 仪器与试剂

采用ABI-9700型PCR仪进行扩增，ABI-3130XL型遗传分析仪进行测序；扩增试剂使用美国 ABI公司生产的Identifiler Plus 试剂盒。

1.3 方法

分为直扩组和对照组两组。直扩组分别剪取每枚烟蒂唾液斑痕处的外层烟纸约 2mm×1mm、海绵约 2mm×0.5mm、以及两者混合物，剪碎后留待扩增。扩增试剂采用Idnetifiler Plus试剂盒，扩增反应体系为25μL，反应体系配比与扩增参数均参照操作说明书推荐参数设置。对照组按上述方法剪取相同检材的烟纸海绵混合物，DNA提取采用行标GA/T383-2014中的Chelex-100方法，扩增试剂亦使用Idnetifiler Plus试剂盒，25μL反应体系，反应体系配比与扩增参数设置同直扩组。以上两组电泳测序信息均由Data Collection 3.0数据收集软件自动收集，采用GeneMapperID v3.2软件进行基因分型。

2 结果

从检验结果看，烟纸的直扩检出成功率仅为12%，海绵的检出成功率高达96%，与对照组的检出率（98%）相比无显著差异，在海绵中加入烟纸对检验结果无显著影响（见表1）。对海绵进行直扩检验所获得的STR分型与用对照组相比无显著差异，但对照组图谱的等位基因间均衡性要稍好，STR分型比较见图1～图3。

表1 三种检验部位的STR分型结果比较

图1 烟纸直扩STR分型结果

图2 海绵直扩STR分型结果

图3 对照组STR分型结果

3 讨论

从检验结果看，对新鲜烟蒂进行直扩检验时，应选取烟蒂的海绵部分，而非烟纸部分。用直扩法检验烟蒂海绵是可行的，结果是可信的，且省去 DNA提取步骤，既节省了检验时间又减少了潜在的污染环节。一些学者认为，海绵中的纤维上含有PCR抑制物，会导致PCR扩增效率低[2]，[4]，但另一些实验[3]则表明，在烟纸中加入烟丝会导致检验失败，而加入海绵则不影响检验结果。笔者认为，海绵纤维本身对PCR的抑制作用并不显著，而烟丝中则存在大量 PCR抑制物，只是由于吸烟者在吸烟过程中，过滤嘴海绵上可能吸附了大量烟丝燃烧残留物，烟纸上吸附的则比较少，所以当使用抗抑制能力不强的扩增试剂盒来检验海绵时，很难得到满意的结果。Identifiler Plus试剂盒的突出特点便是抗抑制能力强，所以用其来做直扩实验时，反而可能由于吸附在海绵上的脱落细胞比吸附在烟纸上的脱落细胞更容易浸泡脱落，从而检验海绵的成功率远远高于检验烟纸的成功率。对于陈旧烟蒂，吸附在烟纸和海绵上的脱落细胞更难浸泡脱落，是否适用直扩法检验还需验证。在本次研究中，虽然检验海绵的检出成功率很高，但所获得STR分型的峰高及等位基因间均衡性还不甚理想，改良扩增反应体系或许会获得更好的结果。在对新鲜烟蒂进行直扩时，还需注意，在剪取海绵时，应选取唾液斑痕较明显处剪取，增加模板浓度可有效提高检出成功率；由于海绵的延展性较好，在扩增前应注意将剪取的检材完全浸没在反应液中，避免因检材漂浮在液面导致检验失败。

[1]哈飞，孙红兵，高海鹏，等.现场生物检材Identifiler Plus直接扩增方法的应用研究[J].中国优生与遗传杂志，2013,21（12）：33-34.

[2]张爱平，陈晓辉，刘长晖，等.放置时间对烟蒂上DNA含量及STR分型的影响[J].法医学杂志，2008,24（6）：423-424.

[3]张庆霞，刘雅诚，唐晖，等.烟蒂DNA分型的研究[J].中国法医学杂志，2003,18（1）：29-30.

[4]陈向红，刘超，李越.荧光标记STR分型进行烟蒂的个人识别[J].中国法医学杂志，2002,17（5）：301-302.