复合碳源填料反硝化脱氮及微生物群落特性

赵文莉，郝瑞霞，王润众，杜 鹏（.北京工业大学北京市水质科学与水环境恢复工程重点实验室，北京0024；2.北京桑德环境工程有限公司，北京 0008）

复合碳源填料反硝化脱氮及微生物群落特性

赵文莉1，2，郝瑞霞1*，王润众1，杜 鹏1（1.北京工业大学北京市水质科学与水环境恢复工程重点实验室，北京100124；2.北京桑德环境工程有限公司，北京 100081）

为探讨低碳氮比污水厂尾水的深度脱氮技术，以碱处理玉米芯、零价铁和活性炭组成的复合碳源作为填料，考察反硝化生物脱氮滤柱的运行效果，并借助Miseq高通量测序技术对滤柱生物膜的微生物群落组成和结构进行解析.结果表明，复合碳源填料进行反硝化脱氮时，能有效的被微生物利用并获得较高的TN去除率.在温度为28℃左右，反硝化滤柱进水浓度为20～30mg/L、HRT=7.7h时，TN去除率可达到95%以上，出水TOC在15mg/L左右；微生物在属水平进行聚类分析结果表明，生物膜中与反硝化作用有关的菌属和与纤维素降解有关的菌属分别占已知菌属的40.35%和29.04%.因此，污泥中反硝化作用菌属和纤维素降解有关的菌属的大量存在，为复合碳源填料高效反硝化作用提供了可能.

复合碳源填料；反硝化脱氮；Miseq高通量测序；微生物群落特性

生物反硝化分为异养型和自养型2种，其中自养型通常以H2或硫单质为电子供体，而异养反硝化需要添加有机碳源作为反硝化微生物生长繁殖的营养源.对于低C/N再生水反硝化生物脱氮常需外加碳源，常规的做法是投加甲醇、乙醇等溶解性碳源［1-2］，这类碳源易溶于水，反应快，但投加量不易控制，容易造成二次污染.

目前已有不少研究者采用固体碳源［3-8］，如玉米芯、棉花、稻杆和竹丝等，这类碳源能避免连续投加，节省成本，简化操作，但却存在反硝化速率低、出水色度高等问题.赵文莉等［9］在预处理方法对玉米芯作为反硝化固体碳源影响研究中发现，碱处理玉米芯的碳源释放量和处理程度最为适宜，有利于反硝化微生物的降解和利用，在运行的41d中，脱氮效率始终维持在90%以上；Rocca等［10］以Fe0和棉花联合去除硝酸盐时发现，Fe0和棉花同时存在时出水中硝酸盐浓度最低，氨氮浓度低于国家标准，但反硝化后期反应器内出现填料层堵塞现象.李斌等［3］在玉米芯与海绵铁复合填料反硝化脱氮特性研究中，也发现复合填料反硝化效果优于单纯玉米芯填料，但也存在填料层堵塞、出水色度高等问题.可见将生物、化学方法联合，发挥各自的优势，对硝酸盐去除有积极的作用，但针对生物、化学联合法中填料层堵塞、出水色度高等问题开发新型复合填料的研究却未见报道.

近年来，越来越多的分子生物学手段被用来研究污水处理过程中微生物群落结构特性，如变性梯度凝胶电泳、克隆文库和高通量测序等.Miseq高通量测序技术以Illumina的边合成边测序技术为基础，通过可逆终止试剂方法对数百万个片段同时进行大规模平行测序，具有分析结果准确、高速等特点，被广泛应用于污水处理过程中微生物群落结构和多样性研究［11-14］.

本研究将活性炭与铁丝、碱处理玉米芯同时填充到聚乙烯球中，作为反硝化滤池的复合碳源填料，以期解决生物、化学反硝化联合法在出水色度高、填料易堵塞等方面的问题，并结合反硝化滤池运行情况及出水水质，利用Miseq高通量测序技术对反硝化滤池中微生物结构进行分析，考察复合碳源填料脱氮及微生物特性.

1 材料与方法

1.1 试验材料

将蒸煮后玉米芯洗净，切成体积约为1cm3的块状，放在80℃的干燥箱中烘干后，放入1.5%NaOH中浸泡18h，洗净，中和，干燥备用.零价铁为市售铁丝球，活性炭为直径在2～4mm的果壳活性炭，直径80mm的聚乙烯悬浮球.

1.2 试验装置及用水

试验DN柱采用有机玻璃制成，内径为200mm，高为1500mm，底部设有穿孔板，起到承托滤料及均匀配水的作用.柱中填充57个直径为80mm的聚乙烯悬浮球，每个悬浮球中填充36g复合碳源填料，复合碳源填料中（碱预处理玉米芯）：（活性炭+铁丝）=5：1.动态试验用水模拟污水厂二级出水最不利水质，由自来水中加入KNO3和KH2PO4，保持C ：N：P=0：5：1，并加入微量元素溶液配制而成.试验进水方式为上向流.

复合碳源填料反硝化脱氮生物滤柱（DN）如图1所示.

图1 复合碳源填料反硝化脱氮生物滤柱示意Fig.1 Schematic layout of denitrification system of composite carbon filler

1.3 试验方法及样品采集

DN柱采用接种挂膜法启动，接种污泥来自北京某污水厂回流污泥，接种前用含一定浓度硝酸钾的生活污水富集培养反硝化细菌.DN柱运行159d，期间环境温度为28℃左右，pH=7.5～8.0，监测运行期间DN柱进出水的TOC、TN、、、及pH值，并在DN柱运行稳定至150d时，采集玉米芯表面的生物膜样品，在-20℃低温冰箱中保存.考察复合碳源填料反硝化生物脱氮工艺的特性及微生物多样性.

1.4 分析指标与方法

1.4．1 常规指标分析 表1列出了常规分析的方法及其所需仪器.

1.4．2 微生物多样性的测定 DNA的提取与PCR的扩增：采用试剂盒法，按照Ezup柱式基因组DNA抽取试剂盒说明书提供的操作步骤提取.提取的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测.PCR的扩增区域为16S rRNA的V3+V4区，其中16S rRNA 的引物名称及引物序列分别为：338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA（测序端）；806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT.PCR采用 TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20μL 反应体系：5×FastPfu Buffer，4μL；2.5mM dNTPs，2μL；Forward Primer（5μmol/L），0.8μL；Reverse Primer （5μmol/ L），0.8μL； FastPfu Polymerase 0.4μL；Template DNA，10ng；补充ddH2O20μL用ABI GeneAmp® 9700型扩增仪扩增，反应程序：先95℃预变性3min；然后进行27个循环（95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s），最后72℃延伸10min.用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN 公司）切胶回收PCR产物，经Tris-HCl 洗脱后，用2%琼脂糖电泳检测.根据电泳初步定量结果，将 PCR产物用QuantiFlourTM-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量，之后按照样品的测序量要求，进行相应比例的混合.

表1 常规分析项目及其所需仪器与方法Table 1 Analysis apparatus and methods

Miseq 文库构建与测序：用高通量测序平台Illumina Miseq 对扩增产物进Miseq高通量测序.Miseq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学分析.

生物多样性与分类学分析：首先将序列按照彼此的相似性归为操作分类单元（OTU）.按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行OTU聚类，采用 RDP classifier 贝叶斯算法对97%相似水平的 OTU 代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类水平：domain（域），kingdom（界），phylum（门），class（纲），order（目），family（科），ge nus（属），species（种）统计各样本的群落组成.

2 结果与分析

2.1 氮去除效果及出水TOC

从图2中可知，挂膜阶段初期，氮去除率较高，可达到100%，这是由于玉米芯表面的可溶性碳源被微生物利用，碳源充足；随后氮去除率逐渐下降稳定至75%左右，出水TOC也由之前的逐渐降低变为稳定的趋势，预示着微生物开始分解纤维素释碳，标志挂膜完成.

图2 氮去除效果及出水TOC变化Fig.2 The removal efficiency of nitrogen and changes of TOC

2.2 pH值的变化

由反应式（1）、（2）可知，生物反硝化过程中通常会产生碱度，使pH值升高.图3为反应器运行过程中进出水pH值变化.从图3的结果可以看出，运行过程中出水pH值均低于进水pH值并且更接近中性，这是因为以玉米芯等纤维素类物质作为反硝化碳源时，纤维素、半纤维素在微生物作用下分解释碳，在分解过程中，纤维素半纤维素逐级水解产生有机酸等简单有机物，中和反硝化产生的一部分碱度，从而使出水pH值低于进水并更趋于中性.熊剑锋等［16］在梧桐树叶作为反硝化碳源的研究中，利用高效液相色谱对其浸出液进行分析，发现其中的主要成分为有机酸类物质，说明溶液中pH值下降是有机酸释放导致；邵留等［17］以稻草为碳源和生物膜载体去除水中硝酸盐的研究中也有类似结论，即在随着反硝化的进行，出水pH值基本维持在中性.因此，纤维素类物质作为反硝化碳源和生物载体时具有稳定体系pH值的能力.

图3 运行过程中pH值变化Fig.3 The changes of pH in the operation process

2.3 玉米芯表面性状特征分析

为了对比反硝化滤池（DN）运行前后玉米芯表面性状和微生物的附着特性，对初始玉米芯及反应130d后的玉米芯表面特性进行扫描电子显微镜（SEM）分析.

图4（a）和（b）是初始玉米芯及反应130d后玉米芯的扫描电镜图.由图4可知，初始玉米芯表面非常粗糙，有较多的孔洞，利于微生物附着生长.反应130d后，玉米芯表面形成致密的生物膜，生物膜主要以球状和杆状微生物为主，成簇生长在玉米芯表面，生物密度较大.有报道指出［18-20］，反硝化细菌为短杆状、弧状和球状微生物，本研究中玉米芯表面生物膜的优势微生物形态与现有相关文献报道基本一致.

图4 反应前及反应130d后玉米芯扫描电镜图片Fig.4 SEM image of corncob by before and after 130days denitrification

2.4 微生物多样性和分类学分析

通过对样品16S rRNA基因库进行Miseq高通量测序，经修剪去杂后，获得29092条优化序列，序列平均长度为438.22bp.将优化序列提取非重复序列、去除没有重复的序列后与Silva库对比后进行聚类，在97%的相似性下获得了182个OUTs，样品的稀释曲线如图5所示，可见测序序列数量大于5000时仍有新的OUT被测出，利用Miseq高通量测序可获得丰富的生物信息；样品的稀释曲线随测序序列增加趋向平坦，说明本研究中样品取样合理.

图5 样品的稀释曲线Fig.5 Rarefaction curve of sample

相似性为97%时样品OUT分类结果如图6所示，样品分类后含有11个已知菌门，其中Proteobacteria菌门和Firmicutes菌门是最主要的菌门，Chlorobi菌门和Bacteroidetes菌门次之.此外样品中有302个序列不能被分至已知菌门，说明这些细菌可能是未知菌种.在Proteobacteria菌门中67.15%是Betaproteobacteria，Betaproteobacteria中大多数细菌趋向于在厌氧环境下通过分解有机物来获取营养物质，一些细菌能利用氢、氨、甲烷和挥发性脂肪酸，被认为与污泥反硝化作用密切相关［27-29］.Firmicutes菌门是一大类细菌，多数为革兰氏阳性，菌体常表现为球状或杆状，有研究表明其可能也与污泥反硝化作用有关［24］.查询《伯杰氏细菌系统分类学手册》可知，Bacteroidetes菌门包括3大类细菌：拟杆菌纲、黄杆菌纲和鞘脂杆菌纲，其中鞘脂杆菌纲重要类群为噬胞菌属，可以降解纤维素.为了得到更详细的微生物群落组成并获得样品中对生物脱氮、纤维素水解起作用的细菌种类，下文将对微生物在属水平进行聚类分析.

图6 样品群落结构分析图（分类到门）Fig.6 Bacterial communities at phylum level of sample

根据 Silva库中的参考序列对进行菌属鉴定，将相对丰度小于1%的菌属合并到其他，分析结果如图7所示.通过对比鉴定样品序列中共检测到82个已知微生物菌属，其中主要菌属有17个.有研究表明［25］，Ruminococcaceae_incertae细菌在降解纤维素方面发挥着重要作用，主要有纤维素分解菌，果胶分解菌，淀粉分解菌等，可将复杂的有机物分解成小分子有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸、丁酸等，并可进一步降解；Cellulomonas是一类革兰氏阳性，能分解纤维素，还原硝酸盐到亚硝酸盐的细菌，大都呈短杆状少数球状；而Spirochaeta细菌具有专一降解半纤维素的功能.这三种与纤维素、半纤维素降解有关的菌属占已知微生物菌属的29.04%.因此反应器中降解纤维素、半纤维素细菌的存在为玉米芯作为反硝化碳源提供了可能.

有研究表明［11，26-29］，生物膜中与反硝化有关的主要菌属包括：Azoarcus菌属、Thauera菌属、Zoogloea菌属、Rhodocyclus菌属、Dechloromonas菌属、Rhodobacter菌属、Comamonas菌属等.在本研究中发现了Rhodocyclaceae unclassified（9.3%）、Thauera（6.25%）、Dechloromonas（3.71%）、Zoogloea（1.49%）和Hydrogenophaga（1.46%）等与反硝化有关的菌属，这类菌属占已知微生物菌属的31.59%.

根据伯杰氏细菌系统学分类手册知，Rhodocyclaceae属于Beta proteobacteria，可划分为10种菌属，其中Azoarcus、Thauera和Zoogloea等8种菌属已证实与反硝化有关［11，30-31］.Thauera是一类革兰氏阴性细菌，大都为杆状且具有反硝化能力，在厌氧条件下，Thauera可以以苯酸盐、乙酸苯酯、乙酸盐和乙醇等有机物作为电子供体进行反硝化，是一种重要的反硝化降解菌［31-32］.

Hydrogenophaga是一类革兰氏阴性兼性嗜氢自养菌，大多为直或稍弯的杆状，有的种可进行厌氧硝酸盐呼吸，具有反硝化作用.微生物样品中存在Hydrogenophaga（嗜氢菌属），可能与复合填料中添加铁丝有关，铁丝在腐蚀过程中产生的H2是氢自养微生物的能源，可以促进氢自养微生物的繁殖，促进反硝化作用的进行.

图7 样品群落结构分析（分类到属）Fig.7 Bacterial communities at genera level of sample

3 结论

3.1 采用复合碳源填料进行生物反硝化脱氮，能有效去除水中硝酸盐，单位质量碱处理玉米芯硝氮去除量为1.32kg/kg，保证较低出水TOC，并避免了填料堵塞和NH4+-N的积累.

3.2 碱处理玉米芯复合填料作为反硝化碳源和生物载体时，具有稳定反硝化体系pH值的能力，出水pH值无显著升高而更趋于中性.

3.3 玉米芯表面SEM图中可以看出，未利用前玉米芯表面非常粗糙，有较多的孔洞；微生物利用后玉米芯表面附有一层致密的生物膜，生物膜中微生物以球状和杆状菌为主，成簇生长在玉米芯的表面.

3.4 Miseq高通量测序结果表明，相似性为97%时，样品聚类后含11个已知菌门，其中与反硝化有关的Proteobacteria菌门（39.38%）和Firmicutes菌门（35.93%）为主要菌门，与纤维素降解有关的Bacteroidetes菌门（6.71%）次之.对微生物种群进行细化分析表明，生物膜中主要存在与纤维素、半纤维素降解有关及反硝化作用有关的菌属，两者分别占已知菌属的比例为29.04%、31.59%.其中反硝化作用菌属的1.46%为Hydrogenophaga（嗜氢菌属），这为系统中可能存在氢自养反硝化菌提供了佐证.

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Denitrification of composite carbon filler and character of microbial community.

ZHAO Wen-li1，2， HAO Rui-xia1*，WANG Run-zhong1， DU Peng1（1.College of Architecture and Civil Engineering， Beijing University of Technology，Beijing 100124， China；2.Beijing Sound Environment Group Ltd， Beijing 100081， China）. China Environmental Science，2015，35（10）：3003～3009

To study advanced denitrogenation of low C/N ratio effluent from municipal wastewater treatment plant， the composite carbon filler composed of corncob pretreated by alkali， zero-valent iron and activated carbon was made. The performance of composite carbon filler denitrification system was investigated and Miseq high-throughput was also applied to study the microbial community structures. Composite media in denitrification could be effectively used and achieve a higher total nitrogen （TN） removal rate. The TN removal efficiency of the denitrification reactor could be above 95% and the concentration of TOC in the effluent was about 15mg/L when the temperature was about 28℃， the Hydraulic Retention Time （HRT） was 7.7h and the inflowwas about 20～30mg/L. The analysis revealed that at the genus level the genera related to denitrifying and degradation of cellulose， was accounted for 40.35% and 29.04% which were related to known bacteria， respectively. So，the masses of denitrifying bacteria and cellulolytic bacterium in the sludge made it feasible to denitrify of composite carbon filler efficiently.

composite carbon filler；denitrification；Miseq high-throughput；character of microbial community

X703.1

A

1000-6923（2015）10-3003-07

赵文莉（1988-），女，河南商丘人，北京工业大学硕士研究生，主要研究方向为污水处理与资源化回用.

2015-03-26

国家自然科学基金项目（51178005）

* 责任作者， 教授， haoruixia@bjut.edu.cn