H9N2亚型禽流感病毒抗原性变异的研究

葛菲菲，刘 健，杨德全，李 鑫，鞠厚斌，周锦萍

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

H9N2亚型禽流感病毒抗原性变异的研究

葛菲菲，刘 健，杨德全，李 鑫，鞠厚斌，周锦萍

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

为了解不同年分离的H9N2亚型禽流感病毒（Avian infl uenza virus，AIV）之间的抗原相关性，挑选2002年、2006～2014年在上海市分离的14株H9N2亚型禽流感病毒，通过血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）交叉试验进行抗原性比较和分析。HI试验结果显示，2002年，2006～2014年这14株H9N2亚型AIV不同毒株间已经发生了抗原漂移，划分成4个不同的抗原群，A/Chicken/Shanghai/Y1/2002和A/Chicken/Shanghai/Y1/2006归为一个抗原群，A/Chicken/Shanghai /C/2011独自成为一个抗原群，A/Pigeon/Shanghai/JC1/2013、A/Chicken/Shanghai/1107/2013归为同一个抗原群，其余毒株均为一个抗原群。综上所述，随着时间的推移，H9N2 AIV抗原发生了不同程度的漂变，但是也存在在某个时间段多种抗原群共存的情况。该研究结果从理论上为上海市制定禽流感防控策略，有效防制H9N2 AIV流行提供了科学的指导，为生产H9N2亚型流感免疫与疫苗候选毒株的选择提供参考依据。

H9N2亚型禽流感病毒；交叉HI试验；抗原漂移

H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）自20世纪90年代以来已经广泛在我国和世界各地流行，不仅给养禽业造成了巨大的经济损失，而且给公共卫生安全造成的隐患不可估量，对人类的健康也构成了巨大的威胁。我国独特的地理环境及养殖模式为AIV感染的发生、传播提供了有利条件，免疫压力及活禽市场的存在又为H9N2 AIV的重组和变异提供了必要条件［1］。目前，H9N2亚型的疫苗已用于常规免疫，在一定程度上控制了H9N2亚型AIV的暴发流行。但是，由于AIV传播快，宿主具有多样性，病毒株血清型众多，不同毒株间毒力差异大，变异性强等特点，造成局部地区仍有流行，且非典型性流行增多，免疫失败也屡见不鲜。Radu等［2］及Kilbourne等［3］指出疫苗株应经常改变，因为老的疫苗株通常仅对新毒株产生部分保护力。1999年，Garcia等［4］证实禽流感暴发期间AIV分离株有很高的变异性，从而导致疫苗无效。Suarez等［5］认为，AIV的变异可引起禽类甚至人类疫苗免疫的失败。刘红旗等［6］研究指出，HA基因的变异可能与频繁的疫苗免疫选择压力有关。本研究通过HI交叉试验来比较分析2002年、2006～2014年上海市分离的H9N2 AIV之间的抗原相关性，探讨其抗原性是否发生漂移，为H9N2亚型禽流感的防制提供参考依据。

1. 材料和方法

1.1 病毒株和基因序列号 A/Chicken/Shanghai/ Y1/2002（GQ 335463～GQ 335470）、A/Chicken/ Shanghai/Y1/2006（GQ 335471～GQ 335478）、A/Duck/Shanghai/C60/2007（KC 768039～KC768046）、A/Chicken/Shanghai/Y1/2007（GQ 335487～ GQ 335494）、A/Chicken/Shanghai/ Y2/2008（GQ 335511～GQ335518）、A/Duck/ Shanghai/C163/2009（KC 768047～KC 768054）、A/Swine/Henan/Y1/2009（KC 768047、KC 768049、KC 768051、KC 768053、KC 768055、KC 768057、KC 768059和KC 768061）、A/ Chicken/Shanghai/A/2010（KJ 726689、KJ 726695、KJ 726701、KJ 7267007、KJ 726713、KJ 726719、KJ 726725和KJ 726731）、A/Chicken/ Shanghai/C/2011（KJ 726691、KJ 726697、KJ 726703、KJ 726709、KJ 726715、KJ 726721、KJ 726727和KJ 726733）、A/Chicken/Shanghai/ C1/2012（KC417046、KC 417049、KC 417052、KC417055、KC 417058、KC 417061、KC 417064和KC 417067）、A/Chicken/Shanghai/C2/2012（KC 417047、KC 417050、KC 417053、KC 417056、KC 417059、KC 417062、K C 4 1 7 0 6 5和K C 4 1 7 0 6 8）、A/P i g e o n/ Shanghai/JC1/2013（KJ128362～128369）、A/Chicken/Shanghai/1107/2013（KJ 726693、KJ 726699、KJ 726705、KJ 726711、KJ 726717、KJ726723、KJ 726729和KJ 726735）和A/ Wild chicken/ Shanghai/C1/2014（KJ 726694、KJ 726700、KJ 726706、KJ 726712、KJ 726718、KJ 726724、KJ 726730和KJ726736），上述14株病毒均为本实验室分离保存。

1.2 主要仪器及试剂 孵化器购自EIFDM8646青岛兴仪电子设备公司；超低温冰箱（MDF- U50V）购自日本SANYO公司；制冰机（FM-120D）购自美国星崎公司）；乳化器（FA25 Fluko）；离心机（5415D Eppendorf）；β-丙内酯购自上海西宝生物科技有限公司；菌检用培养基由本实验室制备。

1.3 SPF鸡与SPF鸡胚 SPF鸡由中国农科院上海兽医研究所提供；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.4 有限稀释法纯化 对1.1中14株H9N2 AIV分别应用有限稀释法进行纯化，吸取病毒尿囊液50μL加入到含青霉素1000 U/mL、链霉素1000 μg/mL的450 μLPBS中，依次进行10倍系列稀释，然后以不同稀释倍数的病毒液接种9～11日龄SPF鸡胚，每枚100μL，平行3胚。接毒后鸡胚继续在孵化箱中孵育48 h后测定血凝，收取并保存最高稀释倍数的具有最高血凝价的鸡胚尿囊液，用于下一轮纯化。如此连续经过3次纯化后，把最后收取的尿囊液105稀释，以100 μL接毒SPF鸡胚，48 h收取尿囊液，混匀后分装，-80℃保存，分装的H9N2病毒液经鉴定无污染后用于后续实验。为防止传代过程中H9N2 AIV丢失及出现杂病毒的情况，对每一次收取的尿囊液进行血凝学及PCR鉴定，准确无误后用于下一轮纯化。

1.5 毒株的鸡胚半数感染量（EID50）测定 将病毒株用无菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-3～10-7个稀释度，各尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚3个，每枚0.1 mL。37℃培养48 h后，逐个测定鸡胚尿囊液HA价，HA效价≥4 log2判为感染，按Reed-Muench方法计算每0.1 mL的EID50。

1.6 灭活疫苗的制备 新鲜尿囊液0.5 mL（稀释至106EID50）加入β-丙内酯，并使其充分混合，β-丙内酯最终浓度为0.1%（V/V），置4℃摇床上灭活12 h，37℃摇床上水解2 h。取灭活的尿囊液9.3 mL，逐滴加入0.7 mL Tween-80。然后在搅拌的同时，把尿囊液和吐温的混合物逐渐加入20 mL白油佐剂中，充分乳化0.5 h，待尿囊液和白油充分包容后即为油乳剂灭活疫苗。

1.7 单因子血清的制备 对26日龄雏鸡采血，取血清进行血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）试验。将HI试验为阴性的雏鸡分成14组，分别用上述灭活疫苗肌肉接种4只26日龄雏鸡，一免后2周进行二免，二免后1周翅静脉采血测HI效价，HI效价达到8～10 1og2时，全部扑杀采集血清，4只鸡的血清混合，60℃水浴10 min灭活。

1.8 交叉HI试验 测定14株病毒的HA滴度，各重复4次，取其平均值，而后将其各配制成4个血凝单位。同一条件下用4个血凝单位的各病毒抗原分别测定上述准备的14种单因子血清对这14株H9N2 AIV株的HI效价，操作按GB/T 18936～2003进行。在微量反应板的1～11孔分别加入0.025 mLPBS，第12孔加入0.05 mL PBS。吸取0.025 mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025 mL于第2孔内，依次倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025 mL弃去。1～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025 mL，室温（约20℃）静置至少30 min。每孔加入0.025 mL体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40 min（室温约20℃），若环境温度太高可置4℃条件下进行。对照红细胞将呈显纽扣状沉于孔底。结果判定以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度，最后比较抗原差异。

2 结果

2.1 HI交叉实验 同一条件下用4个血凝单位的各病毒抗原分别测定上述准备的14种单因子血清对这14株H9N2 AIV株的HI效价，比较抗原差异。其HI滴度（数值应为取log2后的值）详见表1。

表 1 14株H9N2禽流感病毒毒株 HI交叉试验结果Table 1 Cross HI assay result of H9N2 Aviam infl uenza virus strains

2.2 抗原性结果分析 根据Guan等［7］研究，通过PRIMERversion 7.0 （PRIMER-E，Plymouth，United Kingdom）软件分析HI滴度详见图1，其中R1～R14分别代表了上述14株H9N2 AIV。从检测结果可以发现，A/Chicken/Shanghai /Y1 /2002和A/Chicken/Shanghai/ Y1/ 2006同属于一个抗原群，A/Chicken/Shanghai /C/2011独自成为一个抗原群，A/Pigeon/Shanghai/JC1/2013和A/Chicken/ Shanghai/1107/2013归为同一个抗原群，其余毒株均为一个抗原群。整体来看，H9N2 AIV抗原发生了不同程度的漂变，但是在某个时间段，也会存在多种抗原群共存的情况。

图1 14株H9N2亚型禽流感病毒抗原性聚类图Fig. 1 Antigenic analysis of the fourteen H9N2 subtype Avian infl uenza virus strains

3 讨论

本研究结果表明2002年和2006～2014年上海市分离的H9N2亚型禽流感病毒已发生了抗原漂移，14株H9N2亚型禽流感病毒的基因重组模式［8］可以分为5个不同的基因型，2002年和2006～2008年上海市分离的5株H9N2亚型禽流感毒株分别代表了4个不同的基因型：A/Chicken/Shanghai/Y1/2002、A/Chicken/ Shanghai/Y1/2006和A/Duck/Shanghai/C60/2007各单独为一种基因型，A/Chicken/Shanghai/Y1/2007和A/ Chicken/Shanghai/Y2 /2008属于一种基因型。2009年以后分离的9株H9N2 AIV属于另一个基因型。基因型和抗原性有一定的相关性，但是不明显，可能还与HA基因上的主要抗原位点相关，这还需要进一步的分析。Guan等［9］对2000～2005年中国部分省分离的H9N2 AIV进行了抗原性分析，采用Qa/HK/ G1/97、Dk/HK/Y280/97和Ck/HK/G9/97相关的单抗进行分群。刘金华等［10］也进行了相关的研究，选择1996～2008年分离的H9N2 AIV毒株，进行了交叉HI试验，结果表明分离的毒株至少可以分成5个抗原群（A～E），他们认为这些抗原群和基因群存在一定的相关性，也和病毒的分离时间相关。可见，在工作中应加强对流感病毒监测和研究，应该选择与制苗毒株一致的毒株作监测抗原，将与本地区流行的抗原性相近且免疫原性较好的毒株作为疫苗株，才能有效地控制流感的发生和流行。

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ANTIGENIC DRIFT OF H9N2 SUBTYPE AVIAN INFLUENZA VIRUS STRAINS ISOLATED FROM DIFFERENT YEARS

GE Fei-fei， LIU Jian， YANG De-quan， LI Xin， JU Hou-bin， ZHOU Jin-ping
（Shanghai Animal Disease Control Center， Shanghai 201103， China）

To analysis the antigenic characteristics of H9N2 subtype Avian infl uenza virus （AIV） isolated from Shanghai in 2002， 2006-2014， fourteen isolates were analysed by cross-hemagglutinin inhibition test （HI）. The results revealed that antigenic drift had occurred in H9N2 subtype AIV in Shanghai during 2002， 2006-2014. These strains could be classifi ed into four groups. A/chicken/Shanghai/Y1/2002 and A/chicken/ Shanghai/ Y1/2006 belonged to the same antigenic group. One strain A/chicken/Shanghai /C/2011 belonged to the other group. A/pigeon/Shanghai/JC1/2013 and A/ chicken/ Shanghai/1107/2013 belong to the other antigenic group. The remaining virus strains comprised one group. These results indicated that antigenic drift occurred in these years. A variety of antigenically distinct H9N2 AIVs cocirculated in Shanghai during the same period. The result provided scientifi c reference data for the prevention against H9N2 AIVs and the selection of vaccine strains.

H9N2 subtype AIV； cross-hemagglutinin inhibition test ； antigenic drift

S852.659.5

A

1674-6422（2015）05-0010-05

2015-05-05

上海市市级农口系统青年人才成长计划（沪农青字（2014）第2-8号，沪农青字（2015）第2-3号）；沪农科攻字（2015）第1-11号

葛菲菲，女，博士，主要从事分子生物学检测与病毒基因变异研究

周锦萍，E-mail：shzjpvet @163.com.