CCNE1、RIP2基因多态性与膀胱癌发病风险的关系

梁恩利，吴长利，王莹，胡海龙，田大伟

专题研究·肿瘤基因与临床

CCNE1、RIP2基因多态性与膀胱癌发病风险的关系

梁恩利，吴长利△，王莹，胡海龙，田大伟

目的细胞周期蛋白E1（CCNE1）基因和受体相互作用蛋白2（RIP2）基因区域分别存在多态性位点rs8102137和rs42490，探讨这2种多态性与膀胱癌的发病风险及膀胱癌的病理分级和分期之间的关系。方法收集膀胱癌患者（膀胱癌组）176例及非肿瘤体检患者（对照组）210例血样本并提取DNA，聚合酶链反应（PCR）测序方法检测CCNE1（rs8102137）和RIP2（rs42490）的多态性。根据术后病理结果确定膀胱癌患者的分级及分期。分析膀胱癌组和对照组中等位基因和基因型的分布差异。对2组间基因型的分布情况进行比较，分析CCNE1（rs8102137）和RIP2（rs42490）各基因型与膀胱癌患者的临床资料间的关系，及与膀胱癌遗传易感性的关系。结果对照组样本的基因型分布具有良好的群体代表性。CCNE1（rs8102137）突变型（C/T+C/C）在膀胱癌组中频率（40.91%）高于对照组（30.95%，OR=1.54，95%CI：1.02～2.45，P＜0.05）。RIP2（rs42490）突变型（A/G+G/G）在膀胱癌组频率（72.73%）高于对照组（62.38%，OR=1.61，95%CI：1.04～2.48，P＜0.05）。不同膀胱癌病理分级、分期患者的CCNE1（rs8102137）和RIP2（rs42490）基因多态性差异无统计学意义。结论CCNE1（rs8102137）、RIP2（rs42490）基因型与膀胱癌易感性关系密切，携带突变型等位基因的个体患膀胱癌的风险显著高于野生型个体。

膀胱肿瘤；多态现象，遗传；基因；细胞周期蛋白E；受体相互作用蛋白2

世界范围内，膀胱癌发病率位居常见恶性肿瘤的第9位［1］。2012年美国常见恶性肿瘤发病率排名中，膀胱癌位居第6位（新发73 510例，死亡14 880例）［2］。膀胱癌的发病率在我国所有恶性肿瘤中列第10位，且发病率呈逐年上升趋势［3］。本研究旨在探讨细胞周期蛋白E1（CCNE1）、受体相互作用蛋白2（RIP2）基因多态性与膀胱癌发病风险及病理分级、分期之间的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象本研究课题获得天津医科大学第二医院伦理委员会批准。膀胱癌组为2013年2月—12月我科病理证实为膀胱尿路上皮癌患者176例，男142例，女34例，年龄（64.36±12.04）岁。排除标准：曾经患过恶性肿瘤、未知原发灶的转移癌、接受过化疗或放疗的患者。对照组为2013年10月—2014年1月于我院非肿瘤体检者，共210例，男171例，女39例，年龄（66.35±10.91）岁。排除标准：患有精神疾病、近期接受过输血治疗。2组性别（χ2=0.035）、年龄（t= 1.314）差异无统计学意义（P＞0.05）。标本均为化验血常规后废弃的1 mL EDTA抗凝血液标本。

1.2 病理分组肿瘤病理分期根据国际抗癌联盟2009年第7版TNM分期法进行，分为非肌层浸润型膀胱尿路上皮癌（pTa-pT1）和肌层浸润型膀胱尿路上皮癌（pT2-pT4）；肿瘤病理分级根据WHO 2004膀胱尿路上皮癌恶性程度分级系统进行，分为低度恶性倾向尿路上皮乳头状瘤、尿路上皮乳头状癌低级别、尿路上皮乳头状癌高级别，考虑到低度恶性潜能尿路上皮乳头状瘤（papillary urothelial neoplasm of low malignant potential，PUNLMP）易复发、进展快的病理特性且数量极少，将其归类到低级别组。

1.3 实验步骤

1.3.1 基因组DNA提取采用无水乙醇法从膀胱癌患者及非肿瘤对照外周血白细胞中抽提基因组DNA，经测定DNA纯度和进行相应稀释后于-20℃冻存备用。

1.3.2 PCR扩增引物合成应用Primer Premier 5软件针对CCNE1（rs8102137）、RIP2（rs42490）设计PCR引物。CCNE1上游：5′-GATGAGTCCTGCTTGGTTTAGAC-3′；下游：5′-TTATGTAGCCAGTTGGGTTTG-3′。RIP2上游：5′-CTTGT⁃GATCCGTCTAAGTTGTG-3′；下游：5′-TTTGCTTTGTGAAA GTCCCT-3′。产物长度分别为478和495 bp。由北京华大基因研究中心合成引物，为干粉，使用前先离心，再溶解。通常配成储存液浓度为100 μmol/L，-20℃保存；使用浓度为10 μmol/L。94℃10 min，94℃30 s，退火（rs8102137和rs42490的退火温度分别为55℃和57℃）30 s，72℃延伸30 s，31个循环，72℃延伸10 s，4℃保存待用。电泳鉴定PCR产物后进行纯化、测序、分型。

1.4 统计学方法应用统计学软件SPSS 19.0，结合统计学方法中的χ2检验，显著性分别用比值比（OR）和95%置信区间（CI）表示。应用Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验是否具有群体代表性。检验的显著标准α=0.05。

2 结果

2.1 PCR产物准确性的鉴定与Marker（DM2000）作对照，显示CCNE1和RIP2扩增产物纯度较高，条带清晰，见图1、2。

Fig.1 Results of gel electrophoresis of samples containing target gene of CCNE1（rs8102137）图1 部分含CCNE1（rs8102137）多态位点目的基因的电泳结果

Fig.2 Results of gel electrophoresis of samples containing target gene of RIP2（rs42490）图2 部分含RIP2（rs42490）多态位点目的基因的电泳结果

2.2 测序结果测序后，应用oligo6.0软件对CC⁃NE1（rs8102137）基因和RIP2（rs42490）基因序列与所得基因序列进行差异性对比，证实为目的基因，见图3、4。

Fig.3 The polymorphic loci sequencing diagram of CCNE1（rs8102137）图3 CCNE1（rs8102137）多态位点测序峰图（箭头所示）

2.3 CCNE1和RIP2基因单核苷酸多态性在各实验组中的分布CCNE1（rs8102137）检测到的基因型有野生型（T/T）、突变杂合子（C/T）、突变纯合子（C/ C）。PIP2（rs42490）检测到的基因型有野生型（G/ G）、突变杂合子（A/G）、突变纯合子（A/A）。经Har⁃dy-Weinberg遗传平衡定律检验，rs42490和rs8102137基因型频率符合遗传平衡定律（χ2分别为1.906和1.623，均P＞0.05），对照组具有群体代表性。各基因型等位基因频率在膀胱癌组和对照组中的分布见表1。

Fig.4 The polymorphic loci sequencing diagram of RIP2（rs42490）图4 RIP2（rs42490）多态位点测序峰图（箭头所示）

Tab.1 Distribution of CCNE1（rs8102137）and RIP2（rs42490）SNP genotypes and allele frequency in two groups表1 CCNE1（rs8102137）和RIP2（rs42490）等位基因频率（%）

2.4 CCNE1和RIP2基因单核苷酸多态性和膀胱癌易感性的关系以野生型为暴露对照，CCNE1和RIP2基因突变型在对照组低于膀胱癌组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

Tab.2 The relationship between CCNE1（rs8102137）and SNP genotypes and the susceptibility to bladder urothelialcarcinoma表2 CCNE1（rs8102137）和RIP2（rs42490）基因单核苷酸多态性和膀胱尿路上皮癌易感性关系例（%）

Tab.3 The relationship between CCNE1，RIP2 SNP genotypes and the grade and stage of bladder urothelial carcinoma表3 CCNE1和RIP2基因多态性与膀胱尿路上皮癌分级及分期关系

2.5 CCNE1（rs8102137）和PIP2（rs42490）基因单核苷酸多态性与膀胱癌病理分级、分期的关系2组突变型与野生型的病理分级及临床分期比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。

3 讨论

膀胱癌的发生是复杂、多因素、多步骤的病理变化过程，其本质是基因不稳定性。在分子水平上，这种不稳定表现为原癌基因激活、基因修复功能的失常或丧失、凋亡相关基因失衡及抑癌基因失活等；在细胞遗传水平上表现为染色体的异常，如染色体易位、缺失和扩增等；同时涉及细胞的生长、增殖、分化和凋亡等过程的失调控。

CCNE1是一种重要原癌基因，其产物为Cy⁃clinE与CDK2结合，调节细胞增生［4］。许多CCNE1的多态性位点与肿瘤发生、发展的关系已被确认。有两项膀胱癌全基因组关联性分析均发现CCNE1（rs8102137）多态性与膀胱癌易感性及肿瘤的高分级具有相关性［5-6］。在CCNE1基因的5′非编码区的多态性位点rs8102137等位基因C与膀胱癌的发病相关。研究认为CCNE1的过表达与膀胱癌及上尿路移行细胞癌的高级别、高分期及较差的预后相关［7-8］。本研究结果显示，膀胱癌组CCNE1（rs8102137）野生型等位基因型频率显著低于对照组，而突变型等位基因型（C/T+C/C）频率高于对照组，这提示CCNE1（rs8102137）基因突变与膀胱癌的遗传易感性相关，突变可明显增加膀胱癌的患病风险。这可能与CCNE1（rs8102137）基因突变后影响了CCNE1的表达水平，增加细胞内细胞周期蛋白E的含量，致使癌症的发生。但突变与膀胱癌的分期、分级无明显关联。

RIP2属RIP家族成员，RIP与肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）家族成员蛋白的胞外域相作用并且介导下游信号，主要介导核因子（NF）-κB和诱导凋亡［9］。Zhang等［10］研究发现RIP2与膀胱癌转移有关。Guirado等［11］进行了275例膀胱癌病例-对照研究中发现，RIP2内含子区rs42490的多态性与膀胱癌的易感性相关，纯合突变型AA比野生纯合型GG和突变杂合型AG发生膀胱癌的风险要高。本研究分析膀胱癌组RIP2（rs42490）野生型等位基因型频率低于对照组，而突变型等位基因型（C/T+C/C）频率高于对照组，这提示RIP2（rs42490）基因突变与膀胱癌的遗传易感性相关，RIP2（rs42490）突变可明显增加膀胱癌的患病风险与分期、分级无明显关联，这与Guirado等［11］的研究结果是相同的。

总之，CCNE1（rs8102137）和RIP2（rs42490）基因型突变明显增加膀胱尿路上皮癌发病风险，但肿瘤的发生发展是多因素共同作用的复杂过程，因此对更多的肿瘤相关基因做更深入的研究是必要的，这将有助于更好地预防、早期诊断及控制疾病。

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（2014-12-16收稿2015-04-26修回）

（本文编辑魏杰）

Association of genetic polymorphism of CCNE1 and RIP2 with bladder cancer risk

LIANG Enli，WU Changli△，WANG Ying，HU Hailong，TIAN Dawei
Department of Urology，Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin Urology Institute，Tianjin Key Laboratory of Basic Urology，Tianjin 300211，China△

ObjectiveTo evaluate the relationship between the CCNE1 or RIP2，identified at a single nucleotide poly⁃morphism，and the risk，clinic stage and pathological grade of bladder cancer.MethodsPeripheral venous blood samples were obtained from 176 patients with bladder cancer and 210 controls without cancer.DNA was extracted.Polymerase chain reaction（PCR）method was used to detect CCNE1（rs8102137）and RIP2（rs42490）polymorphism.According to the postoper⁃ative pathological results，patients with bladder cancer were determined the grading and staging.The genotype differences of medium gene and the distribution gene were analyzed and compared in bladder cancer group and control group.The relation⁃ship of CCNE1（rs8102137）and RIP2（rs42490）genotypes and clinical data of patients with bladder cancer was analyzed，and the relationship of them with the genetic susceptibility to bladder cancer was also analyzed.ResultsThe genotype dis⁃tribution was with good group representative in control group.The frequency of CCNE1（rs8102137）variant allele was signifi⁃cantly higher in bladder cancer group（40.91%）than that of control group（30.95%，OR=1.54，95%CI：1.02-2.45，P＜0.05）. The frequency of RIP2（rs42490）variant allele was significantly higher in bladder cancer group（72.73%）than that of control group（62.38%，OR=1.61，95%CI：1.04-2.48，P＜0.05）.There were no significant differences in gene polymorphisms of CC⁃NE1（rs8102137）and RIP2（rs42490）between different pathological grades and different clinical stages of bladder cancer. ConclusionThe CCNE1（rs8102137）and RIP2（rs42490）polymorphism have interaction in occurrence of bladder cancer process.There is higher risk of bladder cancer in individuals carrying mutant alleles than that of individuals carrying wild type.

urinary bladder neoplasms；polymorphism，genetic；genes；cyclin E；RIP2

R737.14

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.018

国家自然科学基金资助项目（30700834）；天津市自然科学基金资助项目（12ZCDZSY16600）；天津市应用基础与前沿技术研究计划（14JCYBJC26300）

天津医科大学第二医院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津市泌尿外科基础医学重点实验室（邮编300211）

梁恩利（1981），男，博士在读，主要从事单核苷酸多态性与膀胱癌发病风险相关性方面研究

△通讯作者E-mail：wucl2003@163.com